ANTIGENO DE GLUCOPROTEINA SIMA 135 EXPRESADO EN CELULAS DE TUMOR HUMANAS METASTASICAS.

Una proteína que comprende la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 1, en donde la proteína es una proteína de fosfotirosina

Campo de la Invención

10 La invención se relaciona generalmente con métodos para diagnosticar cáncer y para reducir la metástasis por células de cáncer en un mamífero, tal como un humano. Más específicamente, la invención se relaciona con el uso de una proteína marcadora de tumor para crear anticuerpos que se pueden utilizar para detectar la producción incrementada de la proteína en una célula, y uso de los anticuerpos para reducir la metástasis por células de cáncer que producen la proteína marcadora de tumor.

15 Antecedente de la Invención Un tumor maligno muda células que migran a nuevos tejidos y crean tumores secundarios mientras que un tumor benigno no genera tumores secundarios. El proceso de generar tumores secundarios se denomina metástasis y es un proceso complejo en el que las células de tumor colonizan los lugares distintos del tumor principal. La metástasis de tumor sigue siendo la causa principal de la muerte de los pacientes con

20 cáncer, aún no se entienden claramente los mecanismos moleculares que subyacen a la diseminación de células de tumor. La metástasis es un proceso multi-etapas en el que las células de tumor de se desprenden del tumor principal, invaden la matriz celular, penetran a través de los vasos sanguíneos, entran así en el sistema circulatorio (intravasado), se detienen en un lugar distante, salen del torrente circulatorio (extravasado), y crecen. Ver, por ejemplo, G. L. Nicolson (1982) Biochim. Biophis. Acta. 695: 113-176; G. L. Nicolson y G. Poste (1983) In. Rev. Exp. Pathol. 25: 77-181; G. Poste y I. J. Fidler (1980) Nature 283: 139-145; y E. Roos (1984) Biochim. Biophis. Acta. 738: 263-284. Dada la complejidad del proceso, se piensa que numerosos genes median la metástasis de células de tumor. De hecho, se ha correlacionado el fenotipo metastásico con la expresión de una variedad de proteínas, que incluyen proteasas, moléculas de adhesión, y similares. Sin

30 embargo, falta evidencia o es difícil de probar que una proteína dada está involucrada directamente en la diseminación. L. A. Liotta y W. Stetler-Stevenson (1989) J. Natl. Cancer Inst. 81: 556-557. El carcinoma epidermoide humano, HEp-3, proporciona un único sistema que se puede utilizar para detectar y caracterizar los genes que afectan la diseminación metastásica. Las células HEp-3 que se propagan mediante pasaje serial en la membrana corioalantoidea de pollo (CAM), son cancerígenas y espontáneamente metastásicas (T+M+). L. Ossowski y E. Reich (1980a) Cancer Res. 40: 2300-2309. Sin embargo, cuando tales células se hacen crecer continuamente in vitro, forman fácilmente tumores principales, pero llegan con el tiempo a ser progresivamente no metastásicas (T+M-). L. Ossowski y E. Reich (1980b) Cancer Res. 40: 2310-2315. Con el cultivo prolongado in vitro, ellas eventualmente también llegan a ser no cancerígenas (T-M-). La pérdida de la capacidad metastásica es reversible. Las células T+M

40 llevadas en la membrana corioalantoidea para dos o tres pasajes recuperan la capacidad de formar metástasis espontánea. Así, al alterar las condiciones de crecimiento, el potencial metastásico de estas células se puede manipular por el investigador.

Se muestra que el activador de plasminógeno tipo urocinasa humano (uPA) está involucrado directamente en la diseminación de HEp-3, cuando la metástasis espontánea de las células HEp-3 en los 45 embriones de pollo se inhibe por los anticuerpos que son específicos para el uPA humano. L. Ossowski y E. Reich (1983b) Cell 35: 611-619. Posteriormente, se observa que la inhibición de la actividad de uPA bloquea la infiltración del mesénquima CAM mediante las células HEp-3 individuales. L. Ossowski (1988a) Cell 52: 321-328. Sin embargo, el uPA activo parece ser requerido por la intravasación de células de tumor pero no la extravasación. L. Ossowski (1988a). Así, también algunos otros factores deben estar

involucrados en la diseminación de HEp-3 y en la diseminación de células de cáncer en general. J. P. Quigley et al. (1988) Ciba Foundation Symposium 141: 22-47, Brooks et al. (1993) J. Cell Biol. 122 (6): 1351-1359 y Testa, et al. En las Patentes Estadounidenses Nos 6,245,898 y 6,498,014 se describen la generación de anticuerpos monoclonales (mAbs), utilizando “inmunización sustractiva”, que reconoce los antígenos de la superficie celular expresados en células HEp-3 e inhibe la metástasis de tumor en el modelo de membrana corioalantoidea. No obstante, esos antígenos no se han correlacionado a metástasis in vivo ni han mostrado estar directamente involucrados en el proceso de metástasis in vivo.

Por consiguiente, hay una necesidad de identificar las moléculas biológicas que están involucradas funcionalmente en la diseminación de células de cáncer con el fin de desarrollar terapias que se puedan utilizar para inhibir la migración de las células de tumor a nuevos tejidos. También, son necesarios los métodos para inhibir metástasis de células de tumor y para diagnosticar cáncer para ayudar en la batalla para el control del cáncer al reducir o eliminar la propagación de células neoplásicas a través del cuerpo de un mamífero afligido con cáncer.

Resumen de la Invención

La presente invención se refiere a la identificación y caracterización de una proteína (SIMA135) (SEQ ID NO:1) que se produce en las células metastásicas. La SEQ ID NO:1 se describe como “NCSG135” en la base de datos EBI número de acceso AF 468010. Estas difieren en dos posiciones (residuos 525 & 827) de “B345” descritas en la WO 02/04508.

La invención se define en las reivindicaciones.

Breve Descripción del Dibujo

La Figura 1 ilustra la secuencia de aminoácido de SIMA135. La secuencia de señal está en letras minúsculas y el dominio de transmembrana está encerrado en un recuadro. Doce motivos de Nglucosilación consensos se indican con los triángulos sólidos. Los residuos de tirosina citoplasmáticos se encierran en círculos. Se subrayan los dominios CUB que se considera abarcan los residuos 221 a 348 y 417 a 544. Se sobrerrayan los tres péptidos identificados de la digestión y secuenciación de tripsina. El residuo Arg que precede el péptido 2 y el Lys que precede el péptido 3 se encierran en recuadros para resaltar la consistencia con la especificidad de tripsina para los sustratos que contienen Arg/Lys. Se subrayan las secuencias PXXP del dominio citoplasmático. Un motivo de palmitilación de consenso, seguido por el dominio de transmembrana putativo, se indica por círculos sólidos.

Descripción Detallada de la Invención

La invención se relaciona con el descubrimiento de una proteína glucosilada que se purifica a partir de células HEp3 metastásicas a través de inmunización sustractiva que utiliza un anticuerpo monoclonal designado 41-2. La proteína se designa SIMA135 (inmunización sustractiva de proteína 135 kDa asociada M+ HEp3).

La SIMA135 se refiere a una proteína que puede estar físicamente aislada de las células, en lugar de ser una proteína putativa predicha de traducción de una secuencia de ácido nucleico. El aislamiento físico de la proteína SIMA135 es significativo por un número de razones. Una razón es que el aislamiento de la proteína indica que el mARN se traduce actualmente en un polipéptido. En segundo lugar, el aislamiento y la caracterización de la proteína como se reporta aquí indica que la proteína es glucosilada. El aislamiento físico de la proteína glucosilada confirma que los lugares de glucosilación dentro del polipéptido están disponibles para glucosilación y no se entierran dentro de la proteína plegada para llegar a ser inaccesibles a las glucosiltransferasas. Tal conformación es importante debido a la función conocida que cumple la glucosilación en el plegado de la proteína y la inmunogenicidad. Por lo tanto, el aislamiento de la proteína SIMA135 es un avance significativo cuando se compara con una secuencia de polipéptido predicha de una secuencia de ácido nucleico.

Se muestra aquí que el cADN SIMA135 codifica una proteína de superficie celular de transmembrana tipo I de 135 kDA que inmunorreacciona específicamente con mAb 41-2. La inmunopurificación y secuenciación de aminoácido confirma que la proteína madura comienza en Phe30 luego de la remoción de un péptido de señal de aminoácido 29. El análisis inmunocitoquímico confirma la localización de la proteína en la superficie celular y la orientación tipo I de esta proteína. Adicionalmente, consistente...

1. Una proteína que comprende la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 1, en donde la proteína es una proteína de fosfotirosina.

2. Un fragmento inmunorreactivo soluble de la SEQ ID NO: 1 con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa al reducir SDS-PAGE, y obtenible de medio acondicionado de un cultivo celular HEp3.

3. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al fragmento de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo no es el anticuerpo monoclonal 41-2.

4. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo reconoce una proteína glucosilada que consiste de la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 1, pero no reconoce una proteína no glucosilada que consiste de la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 1.

5. Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 1, para uso en el tratamiento de carcinoma epidermoide o cáncer de próstata, en donde dicho anticuerpo no es el anticuerpo monoclonal 41-2.

6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 y un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Un equipo que comprende el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 y material de empaque.

8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 para uso en un método diagnóstico del cáncer que comprende (a) visualizar la unión de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones con una sección de tejido y (b) determinar si el anticuerpo que origina el teñido heterólogo de la muestra de tejido, indica expresión extensa de SIMA 135 de la SEQ ID No: 1 durante toda la muestra de tejido o glándulas malignas teñidas en la serosa colónica.