ANTICUERPOS ANTI NOGO A HUMANO Y SU USO FARMACÉUTICO.

Un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado o los fragmentos F(ab')2 o Fab de este,

un anticuerpo de cadena sencilla, o un anticuerpo de dominio sencillo capaz de unirse con el polipéptido del NogoA humano, Nogo.A_623-640 humano (SEQ ID NO: 6), que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende: - en secuencia las regiones hipervariables CDR1-:11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 9) y CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10); y -en secuencia las regiones hipervariables CDR1'-11C7 (SEQ ID NO: 11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO: 12) y CDR3'-11C7 (SEQ ID NO: 13)

Esta invención se relaciona con las moléculas de enlace de NogoA, tales como por ejemplo anticuerpos monoclonales o fragmentos Fab de estos.

La regeneración neuronal después de una lesión en el sistema nervioso central (CNS) adulto, se limita debido a la presencia del ambiente inhibidor de mielina que envaina los axones y a la formación de tejido cicatrizante. En los últimos años, importantes conocimientos se han adquirido en el entendimiento molecular de porque el CNS no es capaz de repararse espontáneamente después de una lesión. Las moléculas inhibidoras en la mielina son el principal obstáculo para la regeneración axonal, particularmente inmediatamente después de la lesión. Hasta el momento NogoA, Glicoproteína Asociada con la Mielina (MAG) y glicoproteína mielina-oligodendrocito (OMgp) se han caracterizado como potentes inhibidores del crecimiento neurítico. Además, la mielina también contiene otros componentes inhibidores, tales como, proteoglicanos sulfato de condroitina. Nogo-A es un miembro de la familia de las proteínas reticulon y tiene al menos dos dominios biológicamente activos y farmacológicamente distintos denominados Amino-Nogo y Nogo-66. Mientras que el sitio receptor del formador no se conoce hasta ahora, Nogo-66 inhibe el crecimiento neuronal In vitro e In vivo vía el receptor neuronal NgR. Además de Nogo-66, MAG y OMgp también se unen al NgR con alta afinidad e inhiben el crecimiento neurítico.

Nuevos potenciales enfoques de investigación, que persiguen actualmente la mejora de la reparación de nervios incluyen, la digestión del tejido cicatrizante utilizando una enzima condroitinasa ABC, técnicas puntuales que utilizan células gliales olfatorias y células madre y factores de crecimiento de proteínas para estimular el crecimiento neuronal. Acciones de bloqueo de Inhibidores del crecimiento neurítico por modulación de mediadores de señalización intracelular tales como Rho, una guanosina trisfosfatasa (GTPasa) unida a la membrana, que parece ser un unión clave en la inhibición del crecimiento axonal. La adenosina monofosfato ciclica (cAMP), que puede superar la inhibición asociada de la mielina in vitro e induce la regeneración In vivo. El uso del inhibidor del péptido del receptor NgR (NEP 1-40) para inducir la regeneración neuronal y la recuperación funcional en ratas después de la lesión espinal.

Además del uso de los enfoques descritos anteriormente, también se ha enfocado la atención en el uso de ciertos anticuerpos monoclonales para neutralizar las moléculas inhibidoras del crecimiento de neuritas del sistema nervioso central y periférico, en particular para neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas de NogoA. Utilizando la expresión transgénica regulada de NogoA en células de Schwann del nervio periférico, Cathrine Pot y colaboradores mostraron que la regeneración axonal y la recuperación funcional se deterioran después de un aplastamiento del nervio ciático, indicando que NogoA domina los efectos que promueven y permisivos del crecimiento del nervio periférico lesionado, lo que demuestra su potencia in vivo como un inhibidor de regeneración axonal (J Cell Biol. 2002 Oct 14;159(1):29-35). De esta manera se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal IN-1 o el fragmento Fab IN-1 de este, induce el crecimiento neurítico in vitro y realza la germinación y regeneración in vivo (Schwab ME et al. (1996) Physiol. Rev. 76, 319-370). La experimentación de diferentes dominios de NogoA para la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas, han delineado varios dominios inhibidores en la molécula (Chen et al. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre eta 1. (2000) Nature 403, 439-444; Prinjha et al. (2000) Nature 403, 383-384; ver también el análisis detallado en el Ejemplo 1). Merkler et al., 2001 en este respecto reporta que la aplicación del anticuerpo IN-1 puede realzar la capacidad plástica y regenerativa limitada de los axones en el CNS del mamífero adulto (J Neurosci. 2001 May 15;21(10):3665-73). Incluso, el anticuerpo IN-1 solo tiene una afinidad muy baja con NogoA.

Las inmunoglobulinas o anticuerpos naturales comprenden generalmente una molécula multimérica Y-configurada, que tiene un sitio de enlace de antígeno en el terminal de cada brazo. El resto de la estructura, en particular el tallo de la Y, media las funciones efector asociadas con las inmunoglobulinas. Los anticuerpos consisten de unas 2 cadenas pesadas y 2 livianas. Tanto las cadenas pesadas y livianas comprenden un dominio variable y una parte constante. Un sitio de enlace de antígeno consiste del dominio variable de una cadena pesada asociada con el dominio variable de una cadena liviana. Los dominios variables de las cadenas pesadas y livianas tienen la misma estructura general. Más particularmente, las características del enlace de antígeno de un anticuerpo se determinan esencialmente por 3 regiones específicas en el dominio variable de las cadenas pesadas y livianas que se denominan regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Estas 3 regiones hipervariables alternan con 4 regiones de los marcos (FRs), cuyas secuencias se conservan relativamente y que no se involucran directamente en el enlace. Las CDRs forman bucles y se mantienen en cercana proximidad mediante las regiones de los marcos que adoptan en gran parte una conformación β-lámina. Las CDRs de una cadena pesada junto con las CDRs de la cadena liviana asociadas esencialmente constituyen el sitio de enlace de antígeno de la molécula de anticuerpo. La determinación de lo que constituye una región FR o una CDR usualmente se hace por comparación de la secuencia de aminoácidos de un número de anticuerpos construidos en la misma especie. Las reglas generales para identificar las regiones CDR y FR son del conocimiento general de un experto en el oficio y se pueden por ejemplo encontrar en el sitio web (http://www.bioinf.org.uk/abs/).

En la actualidad, sorprendentemente se ha encontrado que, un novedoso anticuerpo monoclonal de ratón (de ahora en adelante denominado "11C7"), construido contra un fragmento del polipéptido de NogoA de rata (SEQ ID NO: 1) y del tipo IgG1 tiene mejores propiedades que los anticuerpos de NogoA del oficio previo especialmente con respecto a la afinidad de enlace con NogoA de diferentes especies, incluyendo el homo sapiens y con respecto a su mayor actividad de neutralización del crecimiento neurítico de NogoA a una concentración dada del anticuerpo. Además ahora es posible construir otras moléculas de enlace de NogoA, que tienen las mismas regiones hipervariables que el citado anticuerpo.

Por consiguiente, la invención se relaciona con moléculas de enlace con una región particular

o epitope de NogoA (de ahora en adelante denominadas como "las Moléculas de Enlace de la invención" o simplemente "Moléculas de Enlace"). Preferiblemente las Moléculas de Enlace de la invención se unen a NogoA_623-640 humano (fragmento ortólogo contra el cual 11C7 fue construido; = SEQ ID NO: 6) con una constante de disociación (Kd) < 1000nM, más preferiblemente con una Kd < 100 nM, de preferencia con una Kd < 10 nM. La reacción de enlace se puede mostrar por métodos estándar (ensayos cualitativos) incluyendo, por ejemplo, el método de ELISA descrito en el Ejemplo 6 y el método de afinidad biosensor descrito en el ejemplo 7. Además, la unión con NogoA humano y casi más considerablemente la eficacia se puede mostrar en un ensayo de crecimiento neurítico, por ejemplo como se describe a continuación.

En otro aspecto de la invención, la Molécula de Enlace de la invención comprende al menos

a) un primer dominio que comprende en secuencia las regiones hipervariables CDR1-11C7, CDR2-11C7 y CDR3-11C7; dicha CDR1-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, dicha CDR2-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y dicha CDR311C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; y

3 b) un segundo dominio que comprende, en secuencia las regiones hipervariables CDR1'11C7, CDR2'-11C7 y CDR3'-11C7, dicha CDR1'-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, dicha CDR2'-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, y dicha CDR3'-11C7 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Además, la invención también se relaciona con la siguiente Molécula de Enlace, que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno que comprende a) ya sea la parte variable de la cadena pesada de 11C7 (SEQ ID NO: 2); o b) la parte variable de la cadena liviana de 11C7 (SEQ ID NO: 3). Cuando el sitio de enlace de antígeno...

1. Un anticuerpo monoclonal quimérico o humanizado o los fragmentos F(ab')2 o Fab de este, un anticuerpo de cadena sencilla, o un anticuerpo de dominio sencillo capaz de unirse con el polipéptido del NogoA humano, Nogo.A_623-640 humano (SEQ ID NO: 6), que comprende al menos un sitio de enlace de antígeno, dicho sitio de enlace de antígeno que comprende:

- en secuencia las regiones hipervariables CDR1-:11C7 (SEQ ID NO: 8), CDR2-11C7 (SEQ ID NO: 9) y CDR3-11C7 (SEQ ID NO: 10); y -en secuencia las regiones hipervariables CDR1'-11C7 (SEQ ID NO: 11), CDR2'-11C7 (SEQ ID NO: 12) y CDR3'-11C7 (SEQ ID NO: 13).

2. El anticuerpo o fragmento de este, de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende la parte constante de una cadena pesada humana y la parte constante de una cadena liviana humana.

3. El anticuerpo o fragmento de este, de acuerdo con la reivindicación 2, en la cual la parte constante de la cadena pesada humana es del tipo γ4 y la parte constante de la cadena liviana humana es del tipo κ.

4. Un polinucleótido que comprende los polinucleótidos que codifican un anticuerpo o un fragmento de este, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector de expresión que comprende los polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un sistema de expresión que comprende, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho sistema de expresión

o parte de este, es capaz de producir un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuando dicho sistema de expresión o parte de este, está presente en una célula huésped compatible.

7. Una célula huésped aislada, que comprende un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 6.

8. El uso de un anticuerpo o de un fragmento de este, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como un producto farmacéutico.

9. El uso de un anticuerpo o de un fragmento de este, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de reparación de nerviosa.

10. Una composición farmacéutica que comprende, un anticuerpo o fragmento de este de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en asociación con al menos un portador o diluente farmacéuticamente aceptable.