Anticuerpo monoclonal especifico 2C2, obtenido y caracterizado por su capacidad de reconocer epítopos comunes presentes en la exospora de microsporidios de las especies del género Encephalitozoon,

con el fin de ser utilizado en el diagnóstico y caracterización mediante técnicas inmunoquímicas de las microsporidiosis producidas por dichas especies de microsporidios. AcMc 2C2 puede ser aplicado, solo o en combinación con otros agentes, en la preparación de composiciones y en sistemas de detección comerciales para el diagnóstico de dicha enfermedad en humanos y animales

Anticuerpo monoclonal específico 2C2 para el diagnóstico y caracterización de microsporidiosis humanas y animales causadas por especies del género Encephalitozoon.

El objeto de la presente invención es el anticuerpo monoclonal (AcMc) específico 2C2, para ser utilizado mediante conocidas técnicas inmunoquímicas en el diagnóstico de las microsporidiosis humanas y animales producidas por especies del género Encephalitozoon (Encephalitozoon sp). Además, puede ayudar en la caracterización inmunoquímica de los epítopos reconocidos, comunes a las especies pertenecientes a dicho género, y a la localización de dianas terapéuticas que permitan desarrollar nuevos medicamentos o fármacos frente a éste grupo de parásitos.

Estado de la técnica

Los microsporidios son parásitos de distribución cosmopolita que afectan a hospedadores vertebrados e invertebrados. Son organismos de desarrollo intracelular, siendo la espora la forma de resistencia que se libera al medio externo. El conocimiento de los microsporidios como parásitos del hombre es reciente, ya que hasta la aparición del SIDA únicamente se habían descrito casos aislados de afectación humana. Aunque la posibilidad del papel patógeno de estos organismos es controvertida, en la mayoría de las ocasiones su presencia se ha asociado a distintas manifestaciones patológicas que incluyen principalmente al tracto gastrointestinal, genitourinario, respiratorio, muscular y ocular. La mayoría de los estudios publicados parecen indicar una prevalencia de microsporidiosis intestinal alta (entre el 2% y el 60% según los estudios) en individuos VIH-positivos con inmunosupresión severa y diarrea crónica. Se han asociado en ocasiones al fenómeno conocido como "diarrea del viajero", que afecta a personas que viajan a zonas comprendidas en el área tropical y subtropical y experimentan, a su regreso, diarrea de más de 4 días de duración.

Las especies más frecuentes en el hombre son Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon intestinalis, Encephalitozoon cuniculi y Encephalitozoon hellem. La detección de microsporidios se realiza generalmente mediante técnicas de microscopía óptica, método complicado debido al pequeño tamaño de las esporas y a la poca especificidad de las técnicas de tinción convencionales. Los métodos moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), han demostrado mayor sensibilidad y especificidad; y métodos inmunológicos, inmunofluorescencia fundamentalmente, continúan siendo de gran ayuda tanto en la confirmación del diagnóstico como en estudios experimentales. Concretamente la utilización de anticuerpos monoclonales y sueros policlonales específicos se presentan útiles en la identificación al nivel de género y especie. No obstante, dichos métodos no están incluidos en las técnicas de análisis parasitológico de rutina. La importancia en la determinación de la especie radica en la respuesta al tratamiento de elección con albendazol que experimenta el género Encephalitozoon, frente a la respuesta escasa o nula que tiene Enterocytozoon bieneusi con dicho fármaco.

El conocimiento de la presencia de la microsporidiosis en diferentes hospedadores animales es de vital importancia para determinar las posibles vías de transmisión al hombre y poder establecer las medidas profilácticas más adecuadas sobretodo en los grupos de riesgo (enfermos de SIDA, población infantil, población geriátrica, trasplantados, etc). Estudios publicados con datos epidemiológicos en animales han revelado la presencia de estos parásitos en distintos hospedadores animales. En España, los datos publicados sobre la incidencia de éstos parásitos es todavía muy escasa y hace suponer que la presencia de los microsporidios en hospedadores animales próximos al hombre podría estar siendo subestimada en nuestro país.

Para el diagnóstico de la microsporidiosis humanas y animales se ha dependido tradicionalmente de la identificación morfológica de las esporas en muestras biológicas. Hasta hace pocos años, la microscopía electrónica se consideraba como la prueba definitiva para demostrar la presencia de éstos parásitos (Orenstein, 1991). Sin embargo, esta técnica presenta algunos inconvenientes: es cara, requiere mucho tiempo, es poco sensible y se necesita un alto grado de especialización (Didier y col., 1995, 1996). Además, aunque pueda llegarse a la identificación de la espora de microsporidio, no siempre es fácil observar la ultraestructura ni los estadios intracelulares característicos de la especie involucrada. El desarrollo de técnicas de tinción adecuadas, como el Tricrómico Modificado de Weber (Weber y col., 1992) y el Gram-Cromotropo (Moura y col., 1996), ha permitido que estas técnicas se realicen sistemáticamente en muchos laboratorios, y la microscopía electrónica ha quedado relegada a la descripción taxonómica de las diferentes especies al ser una invasiva y cara.

La aplicación de la técnica del Gram-Cromotropo permitió agilizar el diagnóstico debido tanto a la reducción del tiempo empleado en la tinción como en el análisis de la extensión, ya que al aumentar el contraste con el fondo de la preparación se facilita la observación de las esporas. Otras técnicas de tinción también utilizadas por diferentes autores con buenos rendimientos son las de quimioluminiscencia, basadas en la tinción de la quitina de la espora con Calcoflúor (White M2R) o Uvitex 2B (Vávra y col., 1993; Van Gool y col., 1993; Didier y col., 1995c). Sin embargo, las técnicas que utilizan el fluorocromo tienen el inconveniente de que pueden dar lugar a falsos positivos debido a que la quitina de otros organismos, como las levaduras, también reaccionan emitiendo fluorescencia. Por otra parte, no detecta formas inmaduras del parásito, que no tienen totalmente desarrollada la pared externa de quitina.

Sin embargo, las técnicas de tinción no permiten la identificación de la especie, tan sólo es posible una aproximación basada en el tamaño de las esporas para los géneros Enterocytozoon y Encephalitozoon (1-1,6 µm y 2-3 µm respectivamente). Aunque son útiles en estudios de epidemiología y para realizar una primera aproximación al diagnóstico, cada vez se considera más importante la identificación de la especie de los microsporidios detectados en las muestras biológicas (Visvesvara y col., 1994; Weber y col., 1997). Este hecho se debe al difícil tratamiento de los mismos, por la respuesta variable que presentan estos parásitos a los fármacos en uso. De ésta forma, y por lo que respecta a las microsporidiosis intestinales, sólo el albendazol se ha demostrado efectivo frente a las infecciones causadas por Encephalitozoon sp, dando lugar a una erradicación del parásito de los focos de infección (Didier y col., 1996b; Van Gool y col., 1999). En el caso de las microsporidiosis causadas por E. bieneusi, sólo se han podido demostrar mejorías temporales utilizando el mismo fármaco (Schwartz y col., 1997; Van Gool y col., 1999) y metronidazol (Eeftink Schattenkrek y col., 1991).

La identificación de especie es difícil y requiere tiempo y técnicas especializadas como IFI, PCR, Nested-PCR y MET (Microscopía Electrónica de Transmisión). La técnica de IFI se ha mostrado adecuada en el diagnóstico a nivel específico de las microsporidiosis en muestras de procedencia humana y animal (Visvesvara y col., 1991; Zierdt y col., 1993; Schwartz y col., 1993; Aldras y col., 1994; Bornay-Llinares y col., 1998; Moura y col., 1999b). Sin embargo, esta técnica presenta el inconveniente de que ninguno de los antisueros descritos está disponible comercialmente.

Por lo tanto, podemos resumir que las principales ventajas y desventajas de utilizar este tipo de reactivos policlonales son: su bajo coste, fácil producción, se necesitan antígenos puros, los títulos obtenidos son en general bajos, es una mezcla heterogénea de anticuerpos (aunque contenga anticuerpos específicos), variación en los lotes, el suministro es limitado (un animal) y la respuesta no es reproducible en otro animal (irrepetible) (Paul, 1989; Goding y col., 1996).

En los últimos años, diferentes trabajos han demostrado la utilidad de las técnicas de biología molecular (PCR y Nested-PCR) tanto en el diagnóstico como en el estudio de los genotipos implicados en las microsporidiosis humanas y animales, mediante distintos procedimientos de extracción y utilizando diferentes cebadores genéricos y específicos. La especificidad y eficacia de los cebadores utilizados se han probado en estudios previos con muestras biológicas y con esporas procedentes de cultivo, obteniéndose...

1. Anticuerpo monoclonal específico 2C2, producido por el hidrodoma de ratón de la estirpe BALB/c, caracterizado por su capacidad de reconocer epítopos comunes presentes en la exospora de microsporidios de las especies del género Encephalitozoon (Encephalitozoon sp).

2. Uso del anticuerpo monoclonal específico 2C2, según reivindicación 1, solo o en combinación con otros agentes, en la preparación de composiciones y sistemas de detección (kits) comerciales para el diagnóstico mediante técnicas inmunoquímicas de las microsporidiosis humanas y animales producidas por Encephalitozoon sp.

3. Uso del anticuerpo monoclonal específico 2C2 en el diagnóstico de las microsporidiosis humanas y animales producidas por Encephalitozoon intestinalis, según reivindicación 2, donde las técnicas inmunoquímicas de aplicación del anticuerpo monoclonal son técnicas de inmunofluorescencia, indirecta (IFI) y directa (IFD), inmunoenzimáticas, ELISA e inmunoelectrotransferencia (Western-Blot), y microscopia electrónica de transmisión (MET).

4. Composiciones farmacéuticas o veterinarias cuyo agente o principio reactivo es el anticuerpo monoclonal específico 2C2, según reivindicaciones anteriores, utilizables mediante técnicas inmunoquímicas en el diagnóstico de las microsporidiosis humanas y animales producidas por Encephalitozoon sp.