ALERGENOS DE ACAROS DEL POLVO DOMESTICO.

Un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:

a) polipéptidos que comprenden un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1;

b) polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1; y

c) polipéptidos constituidos por un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1

Alergenos de ácaros del polvo doméstico.

La presente invención se refiere a nuevos alergenos de ácaros del polvo doméstico, a polipéptidos derivados de dichos alergenos y polinucleótidos que codifican los mismos. Además, la invención proporciona anticuerpos dirigidos contra los alergenos y el uso de los polipéptidos, polinucleótidos y/o anticuerpos en el tratamiento y el diagnóstico de trastornos alérgicos.

Más del 25% de la población sufre de alergias mediadas por IgE. Los pacientes alérgicos se caracterizan por un aumento en la producción de anticuerpos IgE contra antígenos per se inofensivos (es decir, alergenos). Los síntomas inmediatos de la alergia tipo I (rinoconjuntivis alérgica, asma, dermatitis, shock anafiláctico) los causa la reticulación inducida por alergenos de anticuerpos IgE ligados a células cebadas y la liberación de mediadores biológicamente activos (p. ej. histamina, leucotrienos).

Los ácaros del polvo doméstico (APD) representan una de las fuentes de alergenos más importantes en todo el mundo. Casi el 10% de la población y más del 50% de los pacientes alérgicos están sensibilizados a los alergenos de ácaros. El APD Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) representa la principal fuente de alergenos de interiores en Europa Central (1). Los alergenos de Der p comprenden más de 30 proteínas o glicoproteínas que presentan reactividad cruzada con alergenos de otras especies de ácaros. Hasta la fecha se han caracterizado diecinueve grupos de alergenos. Entre los 19 grupos de alergenos de APD descritos, los grupos 1 y 2 (Der p 1 y Der p 2) constituyen los alergenos más relevantes, pero se ha demostrado que también otros alergenos de APD (p. ej. Der p 5 y Der p 7) representan alergenos de Der p importantes que son reconocidos aproximadamente por el 50% de los pacientes alérgicos a Der p (2).

Pittner et al. (2004) Clin. Exp. Allergy 34: 597 - 603 describen estudios sobre diagnóstico de componentes alergénicos de la alergia a ácaros del polvo doméstico con alergenos de ácaro naturales purificados y recombinantes.

Los extractos crudos de APD que se utilizan en la actualidad para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes alérgicos a APD están estandarizados sólo para Der p 1 y Der p 2, mientras que otros alergenos importantes están presentes en los extractos de APD sólo en cantidades pequeñas. Por lo tanto, la inmunoterapia específica de APD parece ser menos eficiente que la inmunoterapia con alergenos de polen. El uso de alergenos recombinantes para el diagnóstico y el tratamiento podría soslayar este problema.

Por lo tanto, un problema técnico que subyace en la presente invención es identificar y aislar nuevos alergenos responsables de la alergia o la sensibilización a APD.

La solución al anterior problema técnico la proporcionan las realizaciones de la presente invención, caracterizadas en las reivindicaciones.

En particular, los inventores han logrado la identificación de un nuevo alergeno Der p que es útil para el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes alérgicos a Der p. El ADNc que codifica este nuevo alergeno de ácaros se aisló a partir de una biblioteca de ADNc de expresión de Der p, y se expresó en Escherichia coli (E. coli) como alergeno recombinante. El nuevo alergeno, con un peso molecular de 14,7 kDa, se une la IgE de aproximadamente el 30% de los pacientes alérgicos a los ácaros. Se pudo encontrar una identidad de aproximadamente el 50% entre las secuencias de aminoácidos del nuevo alergeno Der p y de los alergenos del grupo 5 de APD y ácaros de almacén (es decir, Der p, Lepidoglyphus destructor, Blomia tropicalis). Sin embargo, no pudo detectarse una reactividad cruzada entre el alergeno recientemente descrito y el Der p 5, demostrando que este nuevo alergeno representa un nuevo grupo de alergenos de APD. Además, los inventores demuestran que el alergeno recombinante es activo biológicamente. En particular, ya a concentraciones de 10 pg/ml el alergeno liberaba cantidades máximas de histamina de los basófilos de los pacientes alérgicos a los ácaros y, en ciertos casos, pudo demostrarse que era incluso más activo que el principal alergeno, el Der p 1, que liberaba cantidades máximas de histamina sólo a una concentración de 1 ng/ml.

Se describe en este documento un polipéptido que muestra reactividad cruzada con los polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1, en particular los aminoácidos 20 a 140 de la misma. El término "reactividad cruzada" significa que una inmunoglubulina particular, preferentemente un anticuerpo IgE, o un fragmento o derivado de la misma que presenta propiedades de unión de la inmunoglobulina completa a epítopos que se unen a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº 1, se une también al polipéptido en cuestión ya que dicho polipéptido en cuestión tiene una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epítopo o determinante que es reconocido por dicha inmunoglobulina particular (preferentemente IgE) en el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. Esto viene a significar que el polipéptido con reactividad cruzada puede ser capaz de desencadenar la reacción alérgica, o al menos la sensibilización, en un individuo que esté expuesto al polipéptido con reactividad cruzada.

La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. El polipéptido comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 75%, más preferentemente una identidad de al menos el 80%, todavía más preferentemente una identidad de al menos el 90% y de la manera más preferente una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. Tal como se usa aquí, el término "polipéptido" se refiere a proteínas y/o péptidos que tienen una longitud de al menos 7 aminoácidos.

El grado de identidad de una secuencia de aminoácidos con la SEC ID Nº 1 se determina comparando la secuencia de aminoácidos en cuestión y la SEC ID Nº 1 usando el programa "BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) con los siguientes parámetros: matriz BLOSUM62; penalizaciones de apertura de huecos 11 (open gap 11) y extensión de huecos 1 (extension gap 1); gap x_dropoff50; valor de E (expect) 10,0 tamaño de palabra 3; filtros: ninguno. De acuerdo con la presente invención, la comparación de secuencias abarca al menos 40 aminoácidos, preferentemente al menos 80 aminoácidos, más preferentemente al menos 100 aminoácidos y de la manera más preferente al menos 120 aminoácidos.

De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SED ID NO 1, de manera más preferente los residuos 20 a 140 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº 1.

Es más, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. La longitud del fragmento es preferentemente de al menos 21 aminoácidos, más preferentemente de al menos 25 aminoácidos, incluso más preferentemente de al menos 35 aminoácidos y de la manera más preferente de al menos 50 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1.

Otra realización más de la presente invención es un polipéptido constituido por al menos 7 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. La longitud de dicho polipéptido es de al menos 10 aminoácidos, más preferentemente de al menos 15 aminoácidos, incluso más preferentemente de al menos 25 aminoácidos y de la manera más preferente de al menos 35 aminoácidos. En otras realizaciones adicionales, el polipéptido de la presente invención consiste en al menos 8 o al menos 9 o al menos 11 o al menos 12 o al menos 13 o al menos 14 o al menos 18 o al menos 21 o al menos 30 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. En otras realizaciones más, la longitud del polipéptido no es superior a 100 o 50 o 30 aminoácidos. Los polipéptidos constituidos por al menos 7 aminoácidos pueden ser reconocidos por linfocitos T (epítopos de los linfocitos T).

Se describe aquí, además, un polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1, siendo...

1. Un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 1.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende los aminoácidos 20 a 140 que se muestran en la SEC ID Nº 1.

4. Un polinucleótido seleccionado del grupo constituido por:

o la hebra complementaria de tal nucleótido.

5. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la Fig. 1A.

6. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende los nucleótidos 81 a 434 de la secuencia que se muestra en la Fig. 1A.

7. Un plásmido o vector que comprende el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Una célula que contiene el plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, no siendo dicha célula una célula dentro de un ser humano.

9. La célula de acuerdo con la reivindicación 8, que se selecciona del grupo constituido por células vegetales, células bacterianas y células de levaduras.

10. Un procedimiento para la preparación del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de cultivar células tal como se define en la reivindicación 8 o 9 en un medio en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido y opcionalmente la posterior recuperación del polipéptido desde las células y/o el medio.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 en el que se rompen las células y se recupera el polipéptido usando cromatografía de intercambio iónico y/o cromatografía de afinidad.

12. Un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

13. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y/o el plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o la célula de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 y/o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, opcionalmente en combinación con uno o más excipientes y/o diluyentes y/o vehículos y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.

14. Un kit de diagnóstico que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y/o el plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o la célula de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 y/o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12.

15. Uso del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y/o el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 y/o el plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 7 y/o la célula de acuerdo con la reivindicación 8 o 9 y/o el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12 para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención o el diagnóstico de un trastorno alérgico, siendo el trastorno alérgico sensibilización o alergia a los ácaros del polvo doméstico o los ácaros de almacén.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 en el que el medicamento debe administrarse a un individuo al que hay que desensibilizar.