ACTIVACION DE CELULAS T ESPECIFICAS DE ANTIGENO POR CELULAS DENDRITICAS TRATADAS CON VIRUS/ANTIGENO.

Un método para la preparación de una composición que contiene células T activadas que puede realizar y estimular una respuesta inmunoespecífica en un paciente,

que comprende las etapas de

(i) preparar las células T del paciente o de un pariente del mismo;

(ii) activar las células dendríticas por un método que comprende las etapas de

(a) preparar como un antígeno una célula tumoral infectada con el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) in vitro,

(b) preparar monocitos del paciente o de un pariente del mismo,

(c) desarrollar células dendríticas de los monocitos por incubación in vitro,

(d) coincubar las células dendríticas obtenidas con el antígeno obtenido en la etapa (a) in vitro,

en el que el virus puede mejorar la adhesión del antígeno a y la presentación del antígeno por las células dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y coseñalización de las células dendríticas;

(iii) preparar un agente de activación de las células T que comprende las células dendríticas de la etapa (ii); y

(iv) activar las células T de la etapa (i) mediante el tratamiento con el agente de activación de las células T de la etapa (iii) in vitro,

en el que las etapas (i), (ii) (a) y (ii) (b) no implican ningún tratamiento quirúrgico del cuerpo de un ser humano o un animal y en el que el pariente del paciente es una persona o un animal que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante el tipo HLA

Activación de células T específicas de antígeno por células dendríticas tratadas con virus/antígeno.

La presente invención se refiere a un método para la preparación de una composición que contiene un agente de activación de células T que contiene células dendríticas (CD) tratadas con antígeno tratado con virus que puede usarse como una vacuna para estimular una respuesta inmune en un paciente.

El sistema inmunológico de pacientes con cáncer y también de los pacientes que padecen enfermedades infecciosas crónicas, enfermedades autoinmunes, fallo renal con necesidad de diálisis o disfunciones inmunohereditarias funciona ineficazmente y necesita ayuda externa. Las causas de esta inmunodeficiencia pueden ser las propias enfermedades o los defectos externamente inducidos que incluyen la inmunosupresión por las terapias convencionales contra el cáncer. Adicionalmente, el reconocimiento de enfermedades como el cáncer o infecciosas por el sistema inmunológico puede enfrentarse a obstáculos tales como presentación débil o ineficaz del antígeno específico para la enfermedad.

Por tanto, la reconstitución de la inmunocompetencia para antígenos específicos es un objeto de investigación intensa. La terapia celular por transferencia de células T específicas de antígeno alogénicas o autólogas activadas in vitro o la inducción in vivo de dichas células por procedimientos de vacunación son estrategias actuales que se dirigen a resolver los problemas de inmunodeficiencia mencionados anteriormente.

Las células T son linfocitos que pueden proporcionar ayuda inmunológica específica y no específica para varios mecanismos inmunes y también puede atacar y erradicar directamente antígenos celulares extraños o asociados a enfermedades. Estas pueden desarrollar y/o transferir memoria inmunológica durante meses y años contra dichos antígenos y por tanto, son mediadores importantes de la protección inmulógica a largo plazo.

Las primeras estrategias desarrolladas para conferir una competencia mejorada a un paciente que padecía de inmunodeficiencia fueron terapias de transferencia celular adoptiva. Estas terapias se usaron principalmente para el tratamiento del cáncer y emplearon en primera instancia los denominados linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y posteriormente linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) activados por linfocinas para la transferencia de autólogos. El término "autólogo" significa que las células que se transfirieron las originó el mismo paciente. Los linfocitos citolíticos se generaron a partir de sangre periférica o de tejido tumoral obtenidos recientes por intervención quirúrgica. Los linfocitos citolíticos obtenidos se cultivaron y se activaron principalmente en medio que contenía interleucina-2 (IL-2), un factor de crecimiento de células T [refs. 1, 2]. Otros intentos de transferencia celular autóloga y alogénica adoptiva incluyen la estimulación de las células T con células tumorales y/o con anticuerpos o citocinas in vitro o in vivo antes de transferirse de manera adoptiva al receptor [refs. 3 a 10]. El término "alogénico" significa que las células transferidas las origina otro individuo.

El uso de células dendríticas (CD) para la activación de células T específicas de antígeno (péptido) in vivo o in vitro se ha establecido en años muy recientes [refs. 8 a 13]. Las CD son células presentadoras de antígeno "profesionales" que pueden ser activadores de células T específicas de antígeno más potentes que las propias células portadoras del antígeno. La CD puede impulsarse o cargarse con antígenos tales como péptidos o lisados celulares, por ejemplo antígenos derivados de células tumorales. Las CD procesan el material antigénico e integran los productos en los complejos CMH (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) de clase I y/o clase II que pueden presentarlos a las células T. Para una completa activación de los linfocitos citolíticos T, se necesita una presentación del material procesado en las dos clases I y II de los complejos CMH, aunque los propios linfocitos citolíticos sólo pueden reconocer una presentación mediante el CMH de clase I. El CMH de clase II es necesario para la activación adicional de las células T auxiliares. Este hallazgo ha conducido a la adición de sustitutos del tipo hemocianina de lapa californiana (HLC) que representan antígenos auxiliares que pueden integrarse en el CMH de clase II. Adicionalmente, dicho sustituto podría representar un neoantígeno y por tanto, puede servir como una molécula indicadora [ref. 8].

El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un paramixovirus aviar que se ha usado durante mucho tiempo en la terapia contra el cáncer. Este virus puede usarse directamente para la infección y lisis de las células cancerígenas in vitro o in vivo y puede usarse para la modificación de células tumorales en vacunas para dar lugar a una adherencia mejorada de las células estimuladoras para sus células diana. El NDV puede inducir también una amplia variedad de señales coestimuladoras para la activación de las células T cuando éste se usa para modificar vacunas celulares [refs. 14 a 22].

Sin embargo, las estrategias mencionadas anteriormente presentan diversos problemas y desventajas.

En el caso del uso de citocinas para la activación y expansión de células inmunes in vitro, los métodos que se han usado anteriormente no han mostrado una relación clínica beneficio-riesgo aceptable. Esto se debe principalmente a una activación inespecífica de todo el sistema inmunitario y a una dependencia de las células transferidas sobre la sustitución de citocinas in vivo después de la aplicación al paciente. El tratamiento resultante de pacientes con dosis elevadas de citocinas se acompaña por efectos secundarios significativos que han conducido a abandonar esta estrategia. Los métodos más sofisticados usan un componente específico de antígeno o un desencadenante de los receptores de las células T para la activación in vitro de las células T además de células producidas por dosis bajas de citocinas que solo muestran una actividad limitada. Habitualmente, la actividad de las células se suprime fácilmente después de la transferencia al paciente, o las células inmunes no encuentran (es decir no migran a) a las células diana in vivo. Por lo tanto, la memoria inmunológica generada de esta manera es únicamente efímera y, además, conduce a la progresión de la enfermedad temprana después del éxito terapéutico ocasional.

Hasta ahora, las CD se han usado clínicamente para la inducción in vivo de respuestas inmunes específicas de antígeno. Sin embargo, los obstáculos que impedían una terapia exitosa usando las CD han sido la generación y/o el aislamiento de una cantidad suficiente de CD funcionalmente activas para la aplicación terapéutica. Las estrategias que se han desarrollado hasta ahora, casi nunca han considerado la posibilidad de una inducción de tolerancia por las CD insuficientemente impulsadas o insuficientemente diferenciadas. Además, la generación in vivo de las respuestas de las células T con las CD puede ser difícil en pacientes con un sistema inmunodeficiente.

La oncolisis in vivo usando el NDV resultó ser difícil debido a una inactivación eficaz del virus por el sistema inmunitario del paciente y debido a las células tumorales resistentes al virus en tumores heterogéneos. Las vacunas de células tumorales modificadas con virus que se han usado hasta ahora para la activación in vivo de células T específicas de antígeno sólo muestran efectos limitados que sólo se observan en las primeras etapas del cáncer. Las estrategias que usan el NDV se enfrentan a otros obstáculos tales como pacientes inmunosuprimidos o inmunodeficientes, células T insuficientemente activas debido a una sobrecarga antigénica en el paciente vacunado o debido a factores inhibidores que producen las células diana para las células T. Adicionalmente, la presentación a antígeno subóptima en células diana para diversos antígenos (es decir, en este caso, tumorales) y en células preexistentes presentadoras de antígeno in vivo pueden ser la razón del fallo de la activación de las células T.

Un problema adicional de las vacunas celulares modificadas con virus que se han desarrollado hasta ahora es que para alcanzar una suficiente eficacia necesitan un número significativo de células viables portadoras de antígeno. Esto ha limitado el uso de vacunas celulares modificadas con virus en aplicaciones clínicas...

1. Un método para la preparación de una composición que contiene células T activadas que puede realizar y estimular una respuesta inmunoespecífica en un paciente, que comprende las etapas de

en el que el virus puede mejorar la adhesión del antígeno a y la presentación del antígeno por las células dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y coseñalización de las células dendríticas;

en el que las etapas (i), (ii) (a) y (ii) (b) no implican ningún tratamiento quirúrgico del cuerpo de un ser humano o un animal y en el que el pariente del paciente es una persona o un animal que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante el tipo HLA.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tratamiento de las células T comprende un tiempo de incubación corto con las células dendríticas activadas no superior a 7 días.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que las células T activadas son al menos en parte células T de memoria.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos parte de las células T a activar y/o al menos parte de los monocitos se preparan a partir de la médula ósea del paciente o del pariente.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tratamiento de las células T se realizan en un medio de cultivo que no contiene más de 6000 U/ml de IL-2.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el método comprende adicionalmente la etapa de inactivar el antígeno obtenido en la etapa (a) sin el uso de radiación.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el antígeno se inactiva por congelación-descongelación o ultrasonido.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células tumorales se preparan del paciente.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula tumoral se purificada adicionalmente mediante técnicas de inmunoperlas.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el antígeno se crioconserva después de su preparación y se congela antes de la coincubación con las células dendríticas en la etapa (d).

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en la etapa (c) el desarrollo de las células dendríticas también se incuba con el virus.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el virus induce al menos en parte fusiones entre el antígeno y las células dendríticas en la etapa (d).

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el sistema inmunológico del paciente está significativamente alterado.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la alteración del sistema inmunitario del paciente está causada por cáncer, infecciones, fallo renal, enfermedades autoinmunes y/o inmunodisfunciones hereditarias.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el paciente es un ser humano.

16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el agente de activación de células T contiene adicionalmente uno o más agentes de activación de células T.

17. Un método para la preparación de un agente de activación de células T que contiene células dendríticas activadas para la activación de células T que realizan y estimulan una respuesta inmunoespecífica en un paciente, en el que las células dendríticas se activan mediante el método que comprende las etapas de

en el que el virus puede mejorar la adhesión del antígeno a y la presentación del antígeno por las células dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y coseñalización de las células dendríticas, en el que las etapas (a) y (b) no implica ningún tratamiento quirúrgico en el cuerpo del ser humano o del animal y en el que el pariente del paciente es una persona o animal que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante el tipo HLA.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el método comprende adicionalmente la etapa de inactivar el antígeno obtenido en la etapa (a) sin el uso de radiación.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el antígeno se inactiva por congelación-descongelación o ultrasonido.

20. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la célula tumoral se prepara del paciente.

21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que la célula tumoral se purifica adicionalmente por técnicas de inmunoperlas.

22. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que el antígeno se crioconserva después de su preparación y se congela antes de la coincubación con las células dendríticas en la etapa (d).

23. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que en la etapa (c) el desarrollo de las células dendríticas también se coincuba con el virus.

24. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que el virus induce al menos en parte fusiones entre el antígeno y las células dendríticas en la etapa (d).

25. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, en el que el sistema inmunológico del paciente está significativamente alterado.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la alteración del sistema inmunológico está causada por cáncer, infecciones, fallo renal, enfermedades autoinmunes y/o inmunodisfunciones hereditarias.

27. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26, en el que el paciente es un ser humano.

28. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, en el que el agente de activación de células T contiene adicionalmente uno o más agentes de activación de células T.

29. Un método para la preparación de células dendríticas activadas que comprende las etapas de

en el que el virus puede mejorar la adhesión y la presentación del antígeno a las células dendríticas y modular la activación, maduración, estabilidad y coseñalización de las células dendríticas, en el que las etapas (a) y (b) no implica ningún tratamiento quirúrgico en el cuerpo del ser humano o del animal y en el que el pariente del paciente es una persona o animal que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante el tipo HLA.

30. Un método para la preparación de células T activadas que comprende las etapas de

en el que la etapa (i) no implica ningún tratamiento quirúrgico del cuerpo del paciente o del pariente y en el que el pariente del paciente es una persona o un animal que está relacionado consanguínea y/o genéticamente con el paciente mediante el tipo HLA.