Purificación de inmunoglobulinas.

Un método para la obtención de una inmunoglobulina en forma monomérica a partir de una solución quecomprende la inmunoglobulina en forma monomérica y en forma agregada,

que se caracteriza porque dicho métodocomprende el siguiente paso:

a) aplicar una solución acuosa, tamponada que comprende dicha inmunoglobulina en forma monomérica y enforma agregada a un material de membrana de intercambio catiónico bajo condiciones en donde al menos el 90% de dicha inmunoglobulina en forma monomérica no se une a dicho material de membrana de intercambio decationes, y recuperar dicha inmunoglobulina en forma monomérica a partir de dicha solución acuosa,

tamponada después de contactar con dicho material de membrana de intercambio catiónico,

por lo que dicho paso a) es un poso cromatográfico que opera en modo de flujo continuo y dicha solución acuosa,tamponada tiene un valor de pH desde pH 4 a pH 8 y dicha solución acuosa, tamponada del paso a) tiene unaconductividad de 1,0 a 15,0 mS / cm y la suma del valor de pH y de la conductividad en mS / cm de la soluciónacuosa, tamponada en el paso a) está en el intervalo de 10 a 15.

Purificación de inmunoglobulinas La presente invención pertenece al campo de la purificación de polipéptidos. Se ha descrito un método para proporcionar una inmunoglobulina en forma monomérica mediante la separación de la inmunoglobulina en solución de impurezas, especialmente de la inmunoglobulina en forma agregada.

Antecedentes de la invención Las proteínas y especialmente las inmunoglobulinas juegan un papel importante en el portafolio médico actual. Para la aplicación en humanos de cada proteína terapéutica tiene que cumplir con criterios distintos. Para garantizar la seguridad de los agentes biofarmacéuticos para los humanos, los ácidos nucleicos, los virus y las proteínas de la célula huésped, que podrían causar un grave daño, tienen que eliminarse especialmente. Para cumplir con estas especificaciones reglamentarias deben seguirse uno o más pasos de purificación tras el proceso de fabricación. Entre otras cosas, la pureza, la velocidad, y el rendimiento juegan un papel importante en la determinación de un proceso de purificación apropiado.

Existen diferentes métodos establecidos y que se utilizan de forma generalizada para la purificación de proteínas,

tales como la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo, cromatografía de afinidad de proteína G o proteína A) , cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, intercambio catiónico (resinas de sulfopropilo o carboximetilo) , de intercambio de aniones (resinas de amino etilo) y de intercambio iónico de modo mixto) , adsorción tiofílica (por ejemplo, con betamercaptoetanol y otros ligandos SH) , de interacción hidrofóbica o cromatografía de adsorción aromática (por ejemplo con resinas de fenilsefarosa, aza arenofílicas, o ácido m

aminofenilborónico) , cromatografía de afinidad de quelato de metal (por ejemplo con material de afinidad Ni (II) y Cu (II) ) , cromatografía de exclusión por tamaño, y métodos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) .

Necina, R., et al. (Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698) describe la captura de anticuerpos monoclonales humanos directamente a partir de sobrenadantes de cultivo de células mediante el intercambio iónico que presenta una alta densidad de carga. En el documento WO 89 / 05157 se describe un método para la purificación de productos de inmunoglobulinas sometiendo directamente el medio de cultivo celular a un tratamiento de intercambio catiónico. Una purificación de anticuerpos IgG monoclonales de un solo paso a partir de ascites de ratón se describe por Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988) , 79-88.

Mhatre, R. et al. (J. Chrom. A 707 (1995) 225-231) , exploró la purificación de los fragmentos Fab de anticuerpos mediante la cromatografía de intercambio catiónico y elución en gradiente de pH.

El documento WO 94 / 00561 describe anticuerpos monoclonales humanos anti-rhesus y líneas celulares que las producen. Un método para purificar un polipéptido por cromatografía de intercambio de iones se describe en el documento WO 2004 / 024866 en el que se utiliza un gradiente de lavado para resolver un polipéptido de interés a partir de uno o más contaminantes. Schwarz, A. y col. (Laborpraxis 21 (1997) 62-66) describen la purificación de anticuerpos monoclonales con una columna CM-HyperD.

El documento WO 2004 / 076485 describe un proceso para la purificación de anticuerpos mediante la proteína A y la cromatografía de intercambio iónico. En el documento PE 0 530 447 se describe un proceso para la purificación de anticuerpos monoclonales de IgG mediante una combinación de tres pasos cromatográficos. La eliminación de la proteína A a partir de preparaciones de anticuerpos se describe en US 4.983.722.

Los procesos de anticuerpos monoclonales recombinantes a menudo emplean cromatografía de intercambio aniónico para unirse a niveles traza de impurezas y contaminantes potenciales, tales como DNA, proteínas de la célula huésped, y virus, al tiempo que permiten que el anticuerpo fluya de forma continua (Knudsen, H.L., et al., J. Chrom. A 907 (2001) 145-154) .

El documento WO 95/16037 describe la purificación de los anticuerpos monoclonales biespecíficos anti-EGF-R/anti-CD3 a partir de hibridoma híbrido realizado mediante la cromatografía de intercambio catiónico de proteína A. La separación de monómeros de anticuerpos de sus multímeros mediante el uso de cromatografía de intercambio iónico se describe en el documento PE 1 084 136. US 5.429.746 se refiere a la aplicación de la cromatografía de combinación de cromatografía de interacción hidrófoba a la purificación de moléculas de proteínas de anticuerpos.

Se describe en US 4.604.208 una membrana microporosa aniónica modificada para su uso en la filtración de líquidos, especialmente en líquidos biológicos o parenterales contaminados con partículas cargadas, . El documento WO 03 / 040166 describe una membrana y un dispositivo diseñados para la eliminación de trazas de impurezas en corrientes que contienen proteínas.

Un método para recuperar un polipéptido se describe en US 6.716.598. En US 2006 / 0194953 se describe un método para eliminar selectivamente proteína A filtrada de un anticuerpo purificado por medio de cromatografía de afinidad de proteína A.

En el documento WO 2006 / 096489 se describe una composición de anticuerpo anti-M-CSF que tiene niveles reducidos de endotoxina. Un método para la purificación de proteínas libre de células del caldo de cultivo o tejido usando un método de unión y elución se describe en JP7155194. Fischer-Fruehholz, S., describe en una presentación aplicaciones de membranas adsorbentes Sartobind (26 de abril de 2006, artículo de internet) . En el documento WO 2006 / 024497 se describe cromatografía de intercambio de iones mediante pulsos de afinidad para purificar los anticuerpos, especialmente la eliminación de la proteína A filtrada. La tarea práctica de la purificación de IgG monoclonal con hidroxiapatita cerámica CHT se describe por Gagnon, P., et al. (11ª Conferencia Anual de Waterside, mayo de 2006) . Fahrner, R. L., et al. Describen la purificación industrial de anticuerpos farmacéuticos, especialmente el desarrollo, el funcionamiento y la validación de los procesos de cromatografía que comprenden un paso de cromatografía de intercambio catiónico en modo de unión y elución (Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 18 (2001) 301-327) .

Resumen de la invención La presente invención comprende múltiples aspectos en el campo de la purificación de inmunoglobulinas. Un aspecto es un método para la purificación de una inmunoglobulina que comprende el paso de aplicar una solución acuosa, tamponada que comprende una inmunoglobulina en forma monomérica y en forma agregada a un material de membrana de intercambio catiónico bajo condiciones en las que al menos el 90 % de la inmunoglobulina en forma monomérica no se une al material de membrana de intercambio de cationes, y recuperar la inmunoglobulina en forma monomérica de la solución después del contacto con el material de membrana de intercambio de cationes, en el que dicho paso es un paso cromatográfico, operado en modo de flujo continuo y dicha solución acuosa, tamponada tiene un valor de pH desde pH 4 a pH 8 y dicha solución acuosa, tamponada tiene una conductividad de 1, 0 a 15, 0 mS / cm y la suma del valor de pH y la conductividad en mS / cm de la solución acuosa, tamponada está en el intervalo de 10 a 15.

En una forma de realización el método comprende, de acuerdo con la invención, un paso más, ya sea antes o después del paso de intercambio catiónico, de la aplicación de una solución acuosa, tamponada que comprende una inmunoglobulina en forma monomérica y / o en forma agregada a un material de intercambio aniónico bajo condiciones en las que la inmunoglobulina no se une al material de intercambio aniónico, y se recupera la inmunoglobulina desde el flujo del material de intercambio aniónico. En una realización, dicho paso es un paso cromatográfico que opera en modo de flujo continuo.

En otra forma de realización el método comprende, de acuerdo con la invención, ya sea antes del paso de intercambio de cationes o antes del paso de intercambio de aniones el paso adicional de aplicar una solución acuosa, tamponada que comprende la inmunoglobulina en forma monomérica y forma agregada a una columna de afinidad bajo condiciones en las que la inmunoglobulina se une a la columna de afinidad, y se recupera la inmunoglobulina en forma monomérica y forma agregada de la columna de afinidad. En una realización, dicho paso es un paso cromatográfico... [Seguir leyendo]

1. Un método para la obtención de una inmunoglobulina en forma monomérica a partir de una solución que comprende la inmunoglobulina en forma monomérica y en forma agregada, que se caracteriza porque dicho método 5 comprende el siguiente paso:

a) aplicar una solución acuosa, tamponada que comprende dicha inmunoglobulina en forma monomérica y en forma agregada a un material de membrana de intercambio catiónico bajo condiciones en donde al menos el 90 % de dicha inmunoglobulina en forma monomérica no se une a dicho material de membrana de intercambio de cationes, y recuperar dicha inmunoglobulina en forma monomérica a partir de dicha solución acuosa, tamponada después de contactar con dicho material de membrana de intercambio catiónico,

por lo que dicho paso a) es un poso cromatográfico que opera en modo de flujo continuo y dicha solución acuosa, tamponada tiene un valor de pH desde pH 4 a pH 8 y dicha solución acuosa, tamponada del paso a) tiene una 15 conductividad de 1, 0 a 15, 0 mS / cm y la suma del valor de pH y de la conductividad en mS / cm de la solución acuosa, tamponada en el paso a) está en el intervalo de 10 a 15.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque dicho material de la membrana de intercambio de cationes es una membrana basada en polietersulfona o una membrana basada en celulosa 20 regenerada modificada con grupos de ácido sulfónico o grupos carboximetilo.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque dicha solución acuosa, tamponada del paso a) tiene un valor de pH entre pH 5 y pH 8.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque dicha solución acuosa, tamponada del paso a) tiene una conductividad de 4, 0 a 10, 0 mS / cm.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque dicha recuperación de dicha inmunoglobulina en forma monomérica del flujo continuo es mediante un método seleccionado a partir de la precipitación, desplazamiento salino, ultrafiltración, diafiltración, liofilización, cromatografía de afinidad, o reducción de volumen de disolvente para obtener una solución concentrada.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, que se caracteriza porque dicha recuperación es por ultrafiltración, liofilización, o reducción de volumen de disolvente.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque dicha inmunoglobulina obtenida del flujo continuo del material de la membrana de intercambio catiónico al menos un 95 % de la inmunoglobulina está en forma monomérica.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque dicha solución acuosa, tamponada es una solución que comprende ácido fosfórico o sales del mismo, ácido cítrico o sales del mismo, o histidina o sales de la misma.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque dicha 45 solución acuosa, tamponada comprende cloruro de sodio o cloruro de potasio.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque dicho paso cromatográfico es una cromatografía en columna o una cromatografía de casete.