Purificación cromatográfica de eritropoyetina humana recombinante.

Método para recuperar y purificar eritropoyetina humana recombinante (EPOhr) a partir de un medio de cultivo celular que comprende células huésped, método que comprende las etapas de:

(a) eliminar células huésped, constituyentes celulares y residuos del medio de cultivo celular realizando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en (i) centrifugación seguida por una etapa de filtración en profundidad, (ii) una etapa de filtración en profundidad y (iii) centrifugación, para obtener un sobrenadante de medio de cultivo clarificado;

(b) ajustar la conductividad del sobrenadante a 5 mS/cm o menos, y un pH de entre aproximadamente 7,0 y 8,0;

(c) aplicar el sobrenadante de la etapa (b) a una columna que comprende un medio cromatográfico de intercambio aniónico, lavar la columna, eluir la EPOhr de la columna y recoger la fracción/fracciones de picos que contienen EPOhr;

(d) someter las fracciones de picos combinadas de la etapa (c) a una etapa de cromatografía de fase inversa usando una resina que puede ejecutarse a presión media (< 10 bar) y es resistente a altas concentraciones de NaOH, eluyéndose la EPOhr usando un gradiente lineal de un disolvente orgánico;

(e) aplicar una o más fracciones eluidas en la etapa (d) que contienen EPOhr a una columna que comprende medios cromatográficos de intercambio aniónico, lavar la columna y eluir la EPOhr usando un gradiente salino lineal;

(f) seleccionar una o más fracciones eluidas en la etapa (e) que contienen EPOhr basándose en el grado de sialilación de la EPOhr; y

(g) someter una o más fracciones eluidas en la etapa (f) que contienen EPOhr a una o más etapas cromatográficas de exclusión molecular usando un medio de filtración en gel para eliminar posibles dímeros y agregados superiores; y recoger el eluato que contiene EPOhr

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2002/013299.

Solicitante: SANDOZ AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: LICHTSTRASSE 35 4056 BASEL SUIZA.

Inventor/es: PALMA, NORBERT, ALLIGER,PETER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/505 (Eritropoyetina (EPO))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)

PDF original: ES-2525945_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Purificación cromatográfica de eritropoyetina humana recombinante Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de eritropoyetina (EPO) humana recombinante con una composición definida de glicoformas en una forma altamente pura, es decir con una baja cantidad de proteínas de la célula huésped. Esto se logra mediante una secuencia específica de etapas de purificación en combinación con una herramienta analítica para cuantificar las ¡soformas separadas.

Antecedentes de la invención

La eritropoyetina es la principal hormona que regula la proliferación y diferenciación de células progenitoras eritroides y el mantenimiento de los niveles fisiológicos de glóbulos rojos circulantes. En el feto, se produce EPO principalmente en el hígado y aproximadamente el 9% de su producción cambia al riñón tras el nacimiento. Cuando los niveles de EPO caen debido a insuficiencia renal aguda o crónica, debe administrarse EPO externamente para prevenir la aparición de anemia. Una eritropoyetina humana activa terapéuticamente ha estado ha estado disponible desde el descubrimiento del gen de EPO y su expresión en células de roedores.

El gen de EPO humano codifica para un péptido señal de 27 aminoácidos y una proteína de 166 aminoácidos con un peso molecular calculado de 18396 Dalton. La proteína madura tiene habitualmente una deleción N-terminal de un aminoácido, y tiene 165 aminoácidos de longitud. La secuencia señal dirige el péptido a los compartimentos celulares implicados en la glicosilación apropiada, conduciendo a una proteína madura con tres sitios de N- glicosilación y uno de O-glicosilación. El resto azúcar, que constituye aproximadamente el 4% del peso molecular total, es esencial para la actividad biológica completa de EPO. Varios estudios han mostrado que el número de residuos de ácido siálico terminales tiene un efecto positivo sobre la semivida in vivo, aunque la actividad in vitro, es decir la unión al receptor, es máxima en la forma no glicosilada o parcialmente glicosilada (Takeuchi y Kobata, 1991, Glycobiology 1 (4): 337-346). El grado de sialilación es directamente proporcional a la semivida, donde las isoformas con menos ácidos siálicos se aclaran del organismo mucho más rápido y por tanto muestran menos actividad.

El objetivo en la generación de una eritropoyetina recombinante altamente activa es crear un producto con un alto grado de residuos de ácido siálico terminales mediante una estrategia de fermentación bien optimizada y mediante un protocolo de purificación selectivo.

Hay numerosas publicaciones sobre la purificación de EPO a partir de diferentes fuentes. Antes de la clonación de la eritropoyetina y el uso de tecnología de ADN recombinante, la mayoría de las purificaciones descritas usaban orina humana como fuente natural. Todos los siguientes protocolos para la purificación de EPO acababan con un producto puro sin énfasis en la acumulación de isoformas definidas. T. Miyake et al., 1977, J. Biol. Chem 252(15): 5558-5564 describen la purificación de EPO urinaria mediante un procedimiento de siete etapas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, precipitación con etanol, filtración en gel y cromatografía de adsorción. Se describe un procedimiento diferente por N. Inoue et al., 1994, Biol. Pharm. Bull., 17(2): 18-184 que usa cromatografía de intercambio aniónico, filtración en gel, cromatografía de lectina y cromatografía de fase inversa para purificar EPO a partir de orina humana. La orina es también la fuente para la purificación de cinco etapas de G. Krystal et al., 1986, Blood, 67(1): 71-79 con Affi-Blue, cromatoenfoque, cromatografía de lectina, cromatografía de fase inversa y SDS- PAGE preparativa. H. Yianagi et al., 1987, J. Chromatogr. 417: 178-182 publican una combinación diferente de las etapas de purificación establecidas anteriormente. Su protocolo de procesamiento posterior (downstream- Processing, DSP) comenzaba con orina purificada mediante precipitación con etanol, dos etapas de cromatografía de lectina, cromatografía de hidroxilapatita y de fase inversa.

V. Broudy et al., 1988, Arch. Biochem. Biophys. 265(2): 329-336 usaron una línea celular BHK transfectada para purificar eritropoyetina mediante cromatografía Affi-Gel blue, cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de fase inversa. La EPO purificada no está enriquecida en isoformas específicas.

A.B. Ghanem, 1994, Prep. Biochem. 24(2): 127-142 y A. Gokana et al., 1997, J. Chromatogr. 791: 19-118 usaron DEAE-Sephacel para separar isoformas de eritropoyetina generadas en una línea celular linfoblastoide B tras una etapa de cromatografía de afinidad. Analizaron el producto purificado mediante isoelectroenfoque, pero no agruparon fracciones con una isoforma definida.

J. Burg et al., documento W99/28346 purificaron EPO hasta un alto grado sobre unidades de N-acetil-lactosamina y/o ramificaciones tetraantenarias en la estructura de hidrato de carbono. La secuencia de DSP comienza con un sobrenadante de cultivo celular, captura mediante cromatografía de afinidad, purificación mediante cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatita y de fase inversa. Los inconvenientes de este procedimiento son una posible fuga del colorante-ligando Cibacron Blue 3G de la matriz de captura de Blue-Sepharose, una

separación bastante débil de proteínas de la célula huésped mediante la etapa de HIC y una resina de RPC a base de sílice que no es estable a la desinfección mediante NaOH.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para recuperar y purificar eritropoyetina humana recombinante 5 (EPOhr) a partir de un medio de cultivo celular que comprende células huésped, método que comprende las etapas de:

(a) eliminar células huésped, constituyentes celulares y residuos del medio de cultivo celular realizando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en (i) centrifugación seguida por una etapa de filtración en profundidad, (ii) una etapa de filtración en profundidad y (iii) centrifugación, para obtener un sobrenadante de medio

de cultivo clarificado;

(b) ajustar la conductividad del sobrenadante a 5 mS/cm o menos, y un pH de entre aproximadamente 7, y 8,;

(c) aplicar el sobrenadante de la etapa (b) a una columna que comprende un medio cromatográfico de intercambio aniónico, lavar la columna, eluir la EPOhr de la columna y recoger la fracción/fracciones de picos que contienen EPOhr;

(d) someter las fracciones de picos combinadas de la etapa (c) a una etapa de cromatografía de fase inversa usando

una resina que puede ejecutarse a presión media (< 1 bar) y es resistente a altas concentraciones de NaOH, eluyéndose la EPOhr usando un gradiente lineal de un disolvente orgánico;

(e) aplicar una o más fracciones eluidas en la etapa (d) que contienen EPOhr a una columna que comprende medios cromatográficos de intercambio aniónico, lavar la columna y eluir la EPOhr usando un gradiente salino lineal;

(f) seleccionar una o más fracciones eluidas en la etapa (e) que contienen EPOhr basándose en el grado de

sialilación de la EPOhr; y

(g) someter una o más fracciones eluidas en la etapa (f) que contienen EPOhr a una o más etapas cromatográficas de exclusión molecular usando un medio de filtración en gel para eliminar posibles dímeros y agregados superiores; y recoger el eluato que contiene EPOhr.

Descripción detallada de la invención

Se ha desarrollado un nuevo protocolo de purificación que hace uso de resinas poliméricas, modernas, que son rígidas y resisten una limpieza rigurosa en lugar de procedimientos que incluyen NaOH 1 M o ácido acético. Además, estas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para recuperar y purificar eritropoyetina humana recombinante (EPOhr) a partir de un medio de cultivo celular que comprende células huésped, método que comprende las etapas de:

(a) eliminar células huésped, constituyentes celulares y residuos del medio de cultivo celular realizando un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en (i) centrifugación seguida por una etapa de filtración en profundidad, (¡i) una etapa de filtración en profundidad y (iii) centrifugación, para obtener un sobrenadante de medio de cultivo clarificado;

(b) ajustar la conductividad del sobrenadante a 5 mS/cm o menos, y un pH de entre aproximadamente 7, y 8,;

(c) aplicar el sobrenadante de la etapa (b) a una columna que comprende un medio cromatográfico de intercambio aniónico, lavar la columna, eluir la EPOhr de la columna y recoger la fracción/fracciones de picos que contienen EPOhr;

(d) someter las fracciones de picos combinadas de la etapa (c) a una etapa de cromatografía de fase inversa usando una resina que puede ejecutarse a presión media (< 1 bar) y es resistente a altas concentraciones de NaOH, eluyéndose la EPOhr usando un gradiente lineal de un disolvente orgánico;

(e) aplicar una o más fracciones eluidas en la etapa (d) que contienen EPOhr a una columna que comprende medios cromatográficos de intercambio aniónico, lavar la columna y eluir la EPOhr usando un gradiente salino lineal;

(f) seleccionar una o más fracciones eluidas en la etapa (e) que contienen EPOhr basándose en el grado de sialilación de la EPOhr; y

(g) someter una o más fracciones eluidas en la etapa (f) que contienen EPOhr a una o más etapas cromatográficas de exclusión molecular usando un medio de filtración en gel para eliminar posibles dímeros y agregados superiores; y recoger el eluato que contiene EPOhr.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la centrifugación en la etapa (a) se realiza usando un separador de discos.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende además, entre la etapa (d) y la etapa (e), la etapa adicional de:

seleccionar una o más fracciones eluidas en la etapa (d) que contienen EPOhr basándose en el grado de sialilación de la EPOhr.

4. Método según la reivindicación 1, en el que antes de la etapa (d), se someten las fracciones de picos de la etapa (c) a una etapa de precipitación con sulfato de amonio para precipitar proteínas contaminantes de la célula huésped, ajustándose entonces la concentración de sulfato de amonio del sobrenadante a una concentración compatible con la etapa (d).

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha concentración es inferior a sulfato de amonio ,24 M.

6. Método según la reivindicación 1, en el que el pH en la etapa (b) es de aproximadamente pH 7,5.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de elución en la etapa (c) se realiza usando un tampón que tiene una concentración de sal de más de 125 mM.

8. Método según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico en la etapa (d) se selecciona del grupo que consiste en acetonitrilo, etanol y hexilenglicol.

9. Método según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de EPO en la etapa (d) se eluye empleando un gradiente lineal del disolvente orgánico de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 1%.

1. Método según la reivindicación 8, en el que el disolvente orgánico en la etapa (d) es acetonitrilo y el polipéptido de EPO se eluye empleando un gradiente de desde aproximadamente el 25% hasta aproximadamente el 5%.

11. Método según la reivindicación 1, en el que antes de la etapa (e) las fracciones eluidas en la etapa (d) se diluyen con un tampón acuoso apropiado.

12. Método según la reivindicación 11, en el que antes de la etapa (e) las fracciones diluidas se dejan durante un

periodo de tiempo apropiado suficiente para inactivar contaminantes virales.

13. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa (g) las fracciones se someten a una etapa de ultrafiltración antes de la etapa de cromatografía de exclusión molecular.

14. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en el que en la etapa (d) las fracciones se someten a una 5 etapa de ultrafiltración antes de la cromatografía de fase inversa.

15. Método según la reivindicación 4, en el que las fracciones de picos combinadas de la etapa (c) se someten a una etapa de ultrafiltración antes de la etapa de precipitación con sulfato de amonio.

16. Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa de nanofiltración de extremo cerrado para eliminar virus antes o después de la etapa (g).

17. Método según la reivindicación 1, en el que en la etapa (a) a cualquiera de los procedimientos (i), (ii) o (iii) le

sigue una etapa de filtración por ,2 pm.

18. Método según la reivindicación 1 ó 3, en el que uno o más de los procedimientos de selección en la etapa (f) o entre la etapa (d) y la etapa (e) se realiza usando electroforesis capilar zonal.