La invención se refiere a un procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas,

mediante la producción de plantas transgénicas que expresan las proteínas recombinantes fusionadas con proteínas asociadas al gránulo de almidón a través de una secuencia reconocida por una proteasa. Este procedimiento permite la purificación de la proteína mediante etapas simples de homogeneización, centrifugación y tratamiento con la proteasa. Así mismo, la invención se refiere a los vectores, hospedadores, células y plantas empleados en dicho procedimiento.

Procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas.

Campo de la invención

La presente invención se engloba dentro del campo de la ingeniería genética y de la biotecnología. Concretamente, la invención se refiere a un procedimiento de obtención de proteínas heterólogas recombinantes purificadas, mediante la producción de plantas transgénicas que expresan las proteínas recombinantes fusionadas con proteínas asociadas al gránulo de almidón a través de una secuencia reconocida por una proteasa. Este procedimiento permite la purificación de la proteína mediante etapas simples de homogeneización, centrifugación y tratamiento con la proteasa. Así mismo, la invención se refiere a los vectores, hospedadores, células y plantas empleados en dicho procedimiento.

Antecedentes de la invención

La utilización de plantas como biofactorías (molecular pharming) se refiere al empleo de plantas para producir compuestos de alto valor añadido que puedan aplicarse a las diferentes industrias, como la farmacéutica, alimenticia, química, etc. Se trata de modificar genéticamente las plantas con el fin de producir el compuesto de interés.

Los sistemas de producción de proteínas recombinantes de interés industrial actualmente emplean bacterias, levaduras y células de mamíferos en cultivo, pero cada uno de estos sistemas presenta sus limitaciones. La utilización de plantas como biofactorías presenta ventajas económicas (costes menores en la producción a gran escala), de seguridad del producto (se evita el riesgo de arrastrar patógenos desde tejidos animales en los procesos de extracción y purificación) y técnicas (en algunos casos las plantas pueden constituir el único sistema capaz de producir eficientemente ciertas proteínas humanas, tales como reguladores del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendrían un impacto negativo en los animales transgénicos o en las células animales cultivadas en las que se expresaran) (Giddings 2001; Ma et al. 2003; Twyman et al. 2003). Por otro lado, proteínas expresadas en semillas pueden permanecer estables durante años a temperatura ambiente sin perder su actividad (Giddings 2001; Ma et al. 2003). Actualmente se están produciendo proteínas de interés terapéutico en una amplia variedad de plantas que incluyen tabaco, cereales, oleaginosas, frutas, hortalizas, forrajeras y algas unicelulares (Twyman et al. 2003; Fischer et al. 2004).

Las proteínas recombinantes expresadas en bacterias son proteínas que no requieren glicosilación para ser activas y generalmente se acumulan en agregados insolubles cuyos costes de purificación y renaturalización no son sostenibles. Cuando las proteínas recombinantes requieren procesos de modificación postraduccionales se utilizan otros sistemas de expresión tales como cultivos celulares de mamíferos que implican un alto costo inicial para su obtención y grandes inversiones adicionales cuando se requiere incrementar la escala de producción. Este problema puede ser solucionado mediante la utilización de plantas como biofactorías, ya que los mecanismos de síntesis y secreción de proteínas y las modificaciones post-traduccionales son los propios de las células eucariotas y permiten la producción y ensamblado de proteínas complejas.

Los objetivos actuales de la industria del "molecular pharming" van encaminados a la obtención de nuevos productos y al incremento de la productividad. Ésta última está determinada en gran medida por los procesos de producción y purificación (Twyman et al. 2005). La mayoría de los costes de producción de una proteína recombinante no recaen en la fase de producción, sino en los procesos posteriores de purificación del producto. Así pues la producción de proteínas recombinantes en ciertos órganos de las plantas o con tecnologías de expresión que localicen a las proteínas recombinantes en un orgánulo en particular de la célula que facilite su purificación, parece un objetivo fundamental a la hora de plantearse el "molecular pharming" como un negocio rentable. Ejemplos de estos nuevos avances son la fusión de proteínas de interés a la oleosina, un tipo de proteína de membrana que forma parte de los cuerpos grasos de las semillas (Markley et al. 2006). Este método de purificación de proteínas recombinantes unidas a oleosinas está basado en la homogeneización de tejidos y posterior purificación de los cuerpos grasos de plantas transgénicas tras un simple paso de centrifugación del homogeneizado y flotación de los cuerpos grasos. Ello, sin embargo, no impide que muchas proteínas solubles contaminen las preparaciones de cuerpos grasos, dificultando la purificación posterior de proteínas recombinantes unidas a las oleosinas. Otras técnicas empleadas son la utilización de pequeñas proteínas de carácter hidrofóbico (hidrofobinas) fusionadas a la proteína recombinante que facilitan su purificación (Joensuu et al. 2010), la producción de proteínas recombinantes que contengan secuencias de integración en la membrana plasmática de las células (Schillberg et al. 2000) o la secreción de las proteínas recombinantes al espacio extracelular o apoplasto (Borisjuk et al. 1999). Sin embargo, todas estas técnicas de purificación de proteínas recombinantes presentan problemáticas similares a la descrita anteriormente basada en la utilización de oleosinas recombinantes.

En la presente invención, se describe por primera vez una estrategia para producir plantas transgénicas que expresen ectópicamente proteínas fusionadas con proteínas unidas al gránulo de almidón (p. ej.: GBSS) a través de una secuencia reconocida por una proteasa. De esta forma la proteína de interés queda anclada al gránulo de almidón, cuya elevada densidad permite una fácil purificación del resto de componentes celulares tras un simple paso de homogeneización del tejido, centrifugación, tratamiento con proteasa y una nueva centrifugación. Por tanto, el nuevo método propone la solubilización de la proteína de interés unida a una estructura no soluble, fácilmente separable de las proteínas solubles del medio. Consecuentemente, el método propuesto es mucho más eficiente que los métodos empleados hasta la fecha, ya que se basa en un simple paso de precipitación.

Breve descripción de la invención

El problema a resolver por la presente invención consiste en permitir la producción a gran escala de proteínas recombinantes purificadas a bajo coste. La solución planteada consiste en un procedimiento basado en la obtención de plantas transgénicas que expresan ectópicamente la proteína recombinante fusionada con una proteína unida al gránulo de almidón, a través de una secuencia de corte de una proteasa. Esto facilita la purificación mediante homogeneización, centrifugación, tratamiento con la proteasa y nueva centrifugación.

Consecuentemente, un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de proteínas heterólogas recombinantes purificadas, que comprende las siguientes etapas:

a) obtener una planta transgénica mediante transformación de una planta silvestre con un vector de expresión que comprende, en dirección 5'-3': un promotor unido a una secuencia nucleotídica que codifica: una proteína unida al gránulo de almidón, seleccionada de: almidón-sintasa unida al gránulo de almidón (GBSS), glucano-diquinasa (R1), enzimas ramificadoras de almidón (BEI, BEIIa, BEIIb), almidón-sintasas solubles (SSI, SSII, SSIII) y almidón-fosforilasa plastidial; un sitio de corte de una proteasa; y una proteína de interés.

b) cultivar la planta transgénica de la etapa a) en condiciones apropiadas para su crecimiento;

c) homogeneizar cualquier tejido de la planta que acumule almidón, seleccionado de: tubérculos, hojas, frutos y semillas;

d) centrifugar y seleccionar la fracción de densidad más elevada, que contiene las proteínas del gránulo de almidón;

e) tratar con la proteasa que reconoce el sitio de corte comprendido en la secuencia descrita en la etapa a);

f) centrifugar y purificar la proteína heteróloga a partir del sobrenadante, mediante cualquier técnica de separación por tamaños, immunoabsorción, intercambio iónico o detección de fluorescencia.

En el procedimiento de la invención, se utilizó la GBSS como ejemplo de proteína unida al gránulo de almidón. Para obtener el vector de transformación, se empleó un vector intermedio,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de obtención de proteínas heterólogas recombinantes purificadas, que comprende las siguientes etapas:

a) obtener una planta transgénica mediante transformación de una planta silvestre con un vector de expresión que comprende, en dirección 5'-3': un promotor unido a una secuencia nucleotídica que codifica: una proteína unida al gránulo de almidón, seleccionada de: almidón-sintasa unida al gránulo de almidón (GBSS), glucano-diquinasa (R1), enzimas ramificadoras de almidón (BEI, BEIIa, BEIIb), almidón-sintasas solubles (SSI, SSII, SSIII) y almidón-fosforilasa plastidial; un sitio de corte de una proteasa; y una proteína de interés.

b) cultivar la planta transgénica de la etapa a) en condiciones apropiadas para su crecimiento;

c) homogeneizar cualquier tejido de la planta que acumule almidón, seleccionado de: tubérculos, hojas, frutos y semillas;

d) centrifugar y seleccionar la fracción de densidad más elevada, que contiene las proteínas del gránulo de almidón;

e) tratar con la proteasa que reconoce el sitio de corte comprendido en la secuencia descrita en la etapa a);

f) centrifugar y purificar la proteína heteróloga a partir del sobrenadante, mediante cualquier técnica de separación por tamaños, immunoabsorción, intercambio iónico o detección de fluorescencia.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el promotor descrito en la etapa a) es constitutivo.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho promotor es el promotor de RNA 35S.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la proteína unida al gránulo de almidón descrita en la etapa a) es R1.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que, la proteína unida al gránulo de almidón descrita en la etapa a) es una enzima ramificadora de almidón, seleccionada del grupo formado por: BEI, BEIIa y BEIIb.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la proteína unida al gránulo de almidón descrita en la etapa a) es la almidón-fosforilasa plastidial.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la proteína unida al gránulo de almidón descrita en la etapa a) es una almidón-sintasa soluble seleccionada del grupo formado por: SSI, SSII y SSIII.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la proteína unida al gránulo de almidón codificada, descrita en la etapa a) es la GBSS o una proteína con al menos un 60% de homología con la GBSS, que se una al gránulo de almidón.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la proteína unida al gránulo de almidón codificada, descrita en la etapa a) es la GBSS.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en el que la secuencia reconocida específicamente por proteasa, descrita en la etapa a) es una secuencia reconocida por trombina.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la proteína recombinante de interés codificada, descrita en la etapa a) es la proteína verde fluorescente (GFP).

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la secuencia nucleotídica codificante de la etapa a) comprende la secuencia representada por SEQ ID Nº: 1.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, en el que la secuencia nucleotídica codificante expresa un polipéptido purificado, cuya secuencia comprende la secuencia representada por SEQ ID Nº: 2.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en el que el vector utilizado en la etapa a) se obtiene partiendo del vector pGWB2-GBSS gtw, que comprende, en sentido 5'-3', el promotor de RNA 35S; una secuencia que codifica la GBSS y una secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attR1 y attR2; mediante incorporación en esta última secuencia, de una secuencia que codifica un sitio de corte de trombina seguido de una secuencia que codifica la GFP.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el vector pGWB2-GBSS gtw se introduce en un hospedador bacteriano.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el hospedador es E. coli.

17. Procedimiento según las reivindicaciones 11-13, en el que el vector de expresión utilizado en la etapa a) es pGWB2-GBSS-Thr-GFP, que comprende, en sentido 5'-3-, el promotor de RNA 35S, una secuencia que codifica la GBSS; una secuencia que codifica un sitio de corte de trombina; y una secuencia que codifica la GFP.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el vector pGWB2-GBSS-Thr-GFP se introduce en un hospedador bacteriano.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho hospedador es Agrobacterium tumefaciens.

20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que la planta transgénica de la etapa a) pertenece a las especies Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana.

21. Un vector para uso en el procedimiento de las reivindicaciones 9-20, que comprende, en sentido 5'-3-, un promotor, una secuencia que codifica la GBSS y una secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attR1 y attR2, el cual permite clonar aguas abajo de GBSS cualquier secuencia nucleotídica flanqueada por secuencias attL1 y attL2.

22. Vector según la reivindicación 21, en el que el promotor es el promotor de RNA 35S, que es el vector pGWB2 GBSS gtw.

23. Un organismo hospedador para uso en el procedimiento de las reivindicaciones 9-20, transformado con un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22.

24. Organismo hospedador según la reivindicación 23, transformado con el vector de la reivindicación 22, siendo dicho organismo la bacteria E. coli.

25. Un vector de expresión para uso en el procedimiento de las reivindicaciones 1-20, que comprende en dirección 5'-3': un promotor unido a una secuencia nucleotídica que codifica: una proteína unida al gránulo de almidón, seleccionada de: almidón-sintasa unida al gránulo de almidón (GBSS), glucano-diquinasa (R1), enzimas ramificadoras de almidón (BEI, BEIIa, BEIIb), almidón-sintasas solubles (SSI, SSII, SSIII) y almidón-fosforilasa plastidial; un sitio de corte de una proteasa; y una proteína de interés.

26. Vector según la reivindicación 25, en el que el promotor es el promotor de RNA 35S, la proteína unida al gránulo de almidón es la GBSS, la proteasa es trombina y la proteína de interés es la GFP, que es el vector pGWB2-GBSS-Thr-GFP.

27. Un organismo hospedador para uso en el procedimiento de las reivindicaciones 1-20, transformado con un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 25-26.

28. Organismo hospedador según la reivindicación 27, siendo dicho organismo una bacteria.

29. Organismo hospedador según la reivindicación 28, transformado con el vector de la reivindicación 26, siendo dicho organismo Agrobacterium tumefaciens.

30. Una célula vegetal transformada con el organismo hospedador de las reivindicaciones 27-29.

31. Una planta transgénica, sus semillas o material de propagación, cuyas células son las de la reivindicación 30.

32. Planta transgénica según la reivindicación 31, caracterizada porque su genoma lleva integrada la secuencia representada por SEQ ID Nº: 1 y expresa la secuencia representada por SEQ ID Nº: 2.

33. Planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 31-32, perteneciente a las especies Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana.