Procedimiento para aumentar la acumulación de almidón y alterar la estructura del almidón en plantas.

El procedimiento consiste en hacer crecer plantas en una atmósfera en la que estén presentes volátiles emitidos por un microorganismo, sin que exista contacto físico entre el microorganismos y la planta, sólo que la planta entre en contacto con los volátiles emitidos por el microorganismo. Se basa en el descubrimiento de que los volátiles emitidos por bacterias Gram positivas o negativas, levaduras y hongos microscópicos promueven un incremento del almidón acumulado y la alteración estructural de este biopolímero. El efecto se observa también en hojas separadas de plantas completas.

Procedimiento para aumentarla acumulaciónde almidónyalterarla estructura delalmidón en plantas.

Campo técnico

La invención se refiere a un procedimiento para incrementar la cantidad de almidón acumulada respecto a las plantas crecidas en condiciones normales. Este procedimiento además permite incrementarel tamaño del gránulodel almidón, alterarel balance amilosa/amilopectinaygradode ramificacióndel almidón. Adicionalmente, lainvenciónse refiere tambiénaun procedimientopara aumentarla cantidadde almidón acumuladaenhojasseparadas de la splantas.

Antecedentes de la invención

Las plantas perciben estímulos bióticos reconociendo multitud de diferentes compuestos señalizadores que se originan en los organismos con los que interactúan. Algunas de estas sustancias representan patrones moleculares asociados a patógenos, que generalmente actúan como desencadenantes de reacciones de defensa. Se perciben a bajas concentracionesy comprendendiversas estructuras, incluidas las de hidratos de carbono, proteínas, glicoproteínas, péptidos, lípidosyesteroles (Hahlbrock et al. 2003: Nonself recognition, transcriptional reprogramming, and secondar y metabolite accumulation during plant/pathogen interactions, Proc Natl. Acad. Sci USA 100 (supl 2) , 1456914576) .

Los microorganismos también sintetizanyemiten muchos compuestosvolátiles con masas moleculares menores que 300 Da, polaridad baja, y una elevada presión de vapor (Schöller et al. 2002: Volatile metabolites from actinomycetes, J.Agric.FoodChem.50, 2615-2621;Schultzand Dickschat2007: Bacterialvolatiles:thesmellofsmall organisms, Nat. Prod. Rep. 24, 814-842; Splivallo et al. 2007a: Discrimination of truffle fruiting body versus mycelial aromas by stir bar sorptive extraction, Phytochemistr y 68, 2584-2598) . El contacto con microorganismos o agentes desencadenantes de reacciones de defensa de plantas no sólo afecta a dichas reacciones de defensa, sino que, muy a menudo, conducenauna disminuciónenlafotosíntesis, yauna transicióndel estadodefuente (enelqueseproducen compuestos orgánicos asimilables) al de sumidero (en el que se importan dichos compuestos asimilables de tejidos en los que están almacenados) (como revisión, véase Berger et al. 2007: Plant physiology meets phytopathology: plant primar y metabolism and plant-pathogen interactions, J. Exp. Bot. 58, 4019-4026) . Una indicación del estado de sumidero en hojas infectadas es la regulación al alza de la invertasa de la pared celular, que da como resultado la reducción de la exportación de sacarosa de la hoja infectada a otras partes de la planta. En algunos casos, la enzima sacarolítica sacarosa sintasa (SuSy) se regula al alza tras el contacto con microorganismos, lo que puede servir para repartir sacarosa ala deposición callosaypromoverla biosíntesisdepolisacáridosde pared celular en los sitiosde infección (Essmann et al. 2008: Leaf carbohydrate metabolism during defense, Plant Signaling& Behvior 3, 885887) . El contacto con patógenos también puede dar como resultado la regulación a la baja de genes implicados en el metabolismo del almidón (Cartieaux et al. 2008:Simultaneous interaction of Arabidopsis thaliana with Bradyrhizobium sp. Strain ORS278and Pseudomonas syringae pv.TomatoDC3000 leads to complex transcriptome changes, Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 244-259;Fabro et al. 2008: Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation, PlantPhysiol.146, 1421-1439) , loquepuedefacilitar la disponibilidad para el patógeno de azúcares simples en los sitios de infección. Estos homopolisacáridos ramificados son sintetizados por la almidón/glucógeno sintasa utilizando ADPglucosa (ADPG) como molécula donadorade azúcar.

El almidón y el glucógeno son los principales hidratos de carbono de almacenamiento en plantas y bacterias, respectivamente, estando su metabolismo estrechamente conectado con el de los aminoácidos por mecanismos todavía poco comprendidos. En Escherichia coli, la privación de aminoácidos desencadena la respuesta a condiciones estrictas, un cambio fisiológico pleiotrópico que hace pasar la célula de un modo relacionado con el crecimiento a un modo de mantenimiento/supervivencia/biosíntesis. En condiciones de limitada provisión de nutrientes (aminoácidos) separaladivisióncelular, y tienelugaruna disminución enla demanda en proteínas dependientesdeATP y enla síntesis y degradaciónde ácidos nucleicos.ElexcesodeATP se desvía entonces desdeel metabolismode ácidos nucleicos/proteínas hacia la biosíntesis de glucógeno si está presente en el medio un exceso de fuentes de carbono (Eydallin et al., 2007b: Genome-wide screening of genes affecting glycogen metabolism in Escherichia coli K-12, FEBS Lett 581, 2947-2953; Montero et al. 2009: Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulator y system at submillimolar environmentalMg2+ concentrations, andis highly interconnected with a wide variety of cellular proceses, Biochem. J. 424, 129-141) . El signo característico de esta respuesta fisiológica pleiotrópica es la acumulación de la alarmona guanosina 5’-difosfato 3’-difosfato (ppGpp) , un nucleótido que se une alaRNApolimerasa bacteriana para potenciarlaexpresiónde genes (incluidos los implicados enel metabolismodel glucógeno) expresadosal comienzodelafase estacionaria.LosnivelesdeppGpp están controladosporRelA (una ppGpp sintasa) ySpoT (una enzima bifuncional que muestra actividadesde ppGpp sintasae hidrolasa) (Potr y kusand Cashel 2008: (p) ppGpp: still magical?, Annu. Rev. Microbiol. 62, 35-51) . Los mutantes de E. coli que tienen daña-dala función relA, ylas células que sobreexpresan spoT muestran un fenotipo deficiente en glucógeno (Montero et al. 2009: Escherichia coli glycogen metabolism is controlled by the PhoP-PhoQ regulator y system at submillimolar environmental Mg2+ concentrations, and is highly interconnected with a wide variety of cellular processes, Biochem.

J. 424, 129-141) . Por el contrario, los mutantes de E. coli que tienen dañada la síntesis de aminoácidos tales como la cisteína muestran unfenotipode glucógeno enexceso como resultadodela respuesta estricta (Eydallin et al., 2007b: Genome-wide screening of genes affecting glycogen metabolism in Escherichia coli K-12, FEBS Lett 581, 29472953) . Estos mutantes muestran un fenotipo de glucógeno normal cuando se cultivan en medio suplementado con cisteína, lo que apuntaalaexistenciade conexiones estrechas entre los metabolismos del azufre, el nitrógenoy el carbono.

Estudios recientes han demostrado que las plantas poseen un sistema regulador mediado por ppGpp similar al que se da en las bacterias, lo cual se ha demostrado que juega un papel crucial en aspectos tales como la fertilidad de las plantas. El ppGpp se acumula en el cloroplasto de hojas estresadas a través de la regulación de la expresión de homólogos de RelA/SpoT (RSH) (Takahashi et al. 2004, Identification of the bacterial alarmone guanosine 5’diphosphate 3’-diphosphate (ppGpp) in plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 4320-4324) .

Al contrarioqueenlas bacterias, dondeladegradacióndelglucógenotienelugaratravés de la ruta fosforolítica, la degradación del almidón en las plantas es principalmente hidrolítica, jugando papeles importantes en la degradación del almidónde endospermosycerealesdehojaslas α-amilasasylas β-amilasas, respectivamente (Scheidig et al. 2002: Downregulationofa chloroplast-targeted β-amylase leadstoa starch-excess phenotypeinleaves, PlantJ.30, 581-591; Fulton et al. 2008: β-amylase4, a noncatalytic protein required for starch breakdown, acts usptream of three active βamylases in Arabidopsis chloroplasts, Plant Cell 20, 1040-1058) . Desde la demostración inicial de que ADPG sirve como molécula precursora para la biosíntesis tanto del glucógeno de las bacterias como del almidón de las plantas, ha estado bastante extendida la consideración de que la ADPG pirofosforilasa (AGP) es la única enzima que cataliza la producción de ADPG. La evidencia genética de que la biosíntesis de glucógeno bacteriano ocurre solamente por la ruta deAGP (GlgC) se ha obtenido con mutantes glgC. Sin embargo, recientes estudios han demostrado que estos mutantes acumulan cantidades sustancialesde glucógenoy un contenido normalde ADPG. Además, se han aportado evidenciasque demuestranlaexistenciadediversas fuentes importantes, diferentesde GlgC, de ADPGligadasala biosíntesis del glucógeno endiferentes especies bacterianas.

Generalmente, la biosíntesis de almidón en hojas se ha considerado que tiene lugar exclusivamente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para incrementar la cantidad de almidón acumulado en distintos órganos de una planta, caracterizado por que la planta o las hojas desprendidas de la misma se mantienen en presencia de un cultivo de un microorganismoque produce compuestosvolátiles, sinqueexista contacto entreel microorganismoyla plantaolas hojas desprendidas, o en presencia de los volátiles emitidos por el microorganismo.

2.Métodosegúnlareivindicación1, enelque adicionalmentese produceun incrementoel tamañodelos gránulos de almidónyse obtiene un almidón modificado, enel queel contenido relativode amilosayel gradode polimeración de las cadenas de amilopectina son menores que los del almidón producido por las plantas control crecidas en ausencia de volátiles microbianos.

3.Métodosegúnlareivindicación1ó2, enelqueel microorganismoes una bacteria, unalevaduraounhongo pluricelular microscópico.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el microorganismo es una levadura.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la levadura pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae.

6. Método según una cualquierade las reivindicaciones1 a5, enel queelcrecimiento del microorganismo se produce en un medio que carece de compuestos orgánicos que presenten grupos amino.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el crecimiento del microorganismo se produce en un medio que carecede aminoácidosy/oproteínas.

8. Método según la reivindicación6ó7, en el que el crecimiento del microorganismo se produce en un medio mínimo suplementado con una fuente de carbono orgánico.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el microorganismo es una bacteria perteneciente a un género del grupo de Salmonella, Agrobacterium, Bacillus, Escherichia o Pseudomonas.

10. Método según la reivindicación 9, en el que el microorganismo se selecciona del grupo de: Bacillus. subtilis 168, Salmonella enterica (LT2) , Escherichia. coli (BW25113) , Agrobacterium tumefaciens EHA105, Agrobacterium tumefaciens GV2260, Pseudomonas syringae 1448A9, Pseudomonas syringae 49a/90, Pseudomonas syringae PK2.

11. Métodosegúnlareivindicación6, enelqueelmicroorganismoesunhongo pertenecientealgénero Penicillium

o Alternaria.

12.Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la planta es una angiosperma, monocotiledónea o dicotiledónea.

13. Método según la reivindicación 12, en el que la planta se selecciona del grupo de plantas de patata, plantas de maíz, plantas de tabaco, plantas de cebada o plantas de la especie Arabidopsis thaliana.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la planta es una planta de patata, una planta de maíz, una planta de tabacoouna plantadela especie Arabidopsis thaliana que se cultiva en presencia de un hongo perteneciente al género Alternaria o Penicilliumque se deja crecer en medio mínimo suplementado con una fuente de carbono orgánico, sin queexista contacto físico entrela plantayel microorganismo.

15. Método según la reivindicación 13, en el que medio se suplementa con sacarosa.

16. Métodosegúnlareivindicación15, enelquelaplantaesunaplantadepatataounaplantademaíz.

17. Métodosegún una cualquieradelasreivindicaciones1 a16, enelquelosórganosenlosquese produceel incremento de la cantidad de almidón acumulada son hojas, raíces, tallos y/o tubérculos.

18. Métodosegún una cualquieradelasreivindicaciones1a17, enelquela planta completase cultivaen presencia de un cultivode un microorganismoque produce compuestos volátiles, sin queexista contacto entrela plantay el microorganismo, o en presencia de los volátiles emitidos por el microorganismo.

19. Método según la reivindicación 18, en el que la planta se cultiva in vitro o en tierra.

20. Métodosegún una cualquieradelasreivindicaciones1 a19, enelquela plantase cultivaen una atmósfera en la que están presentes los compuestos volátiles emitidos por un microorganismo que ha sido cultivado en un lugar diferenteallugarde cultivodela planta.

21. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el órgano en el que se produce el incremento de la cantidad de almidón son hojas separadas de la planta completa.

22. Método según la reivindicación 21, en el que el microorganismo es un hongo del género Alternaria

23. Métodosegúnlareivindicación21ó22, enelquelashojassonhojasdeplantadepatata.

24. Métodosegúnuna cualquieradelasreivindicaciones21a23, enelquelashojasse mantienenal menos2días en presencia del cultivo de microorganismo, en contacto con los volátiles emitidos por el microorganismo.