Placa para gotitas suspendidas.

Una placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) que comprende un número predeterminado de compartimentos de gotita

(10; 30; 50; 60; 90) cada uno de los cuales puede recibir una gotita (20, 21; 40, 41, 42; 60, 61, 52, 63, 64) de un líquido, comprendiendo el respectivo compartimento de gotita (10; 30; 50; 60; 90) una barrera humectante microfluídica circunferencial (102; 302; 502; 702; 902) dispuesta para rodear una respectiva cavidad (100; 500) e impidiendo que una gotita se extienda más allá de la barrera humectante microfluídica,

en el que el respectivo compartimento de gotita (10; 30; 50; 60; 90) comprende un fondo cerrado (101; 501) y por lo menos una barrera humectante microfluídica circunferencial adicional (104; 304, 306; 504, 506, 508, 510; 604, 606; 904, 906), estando dispuesta cada barrera humectante microfluídica circunferencial adicional (104; 304, 306; 504, 506, 508, 510; 604, 606; 904, 906) para rodear una barrera humectante microfluídica circunferencial precedente (102; 302, 304; 502, 504, 506, 508; 604, 606; 904, 906), estando dispuesta un área humectable (103; 303, 305; 503, 505, 507, 509) entre dos barreras humectantes microfluídicas dispuestas de manera adyacente.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2012/053588.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: GRENZACHERSTRASSE 124 4070 BASEL SUIZA.

Inventor/es: VOEGELIN,DIETER, FATTINGER,CHRISTOF, ZUMSTEIN,THOMAS, IAIZA,PATRICK, KISSLING,TOM, MCGINNIS,CLAUDIA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones... > C12M3/00 (Equipos para el cultivo de tejidos, de células humanas, animales o vegetales, o de virus)

PDF original: ES-2546159_T3.pdf

 

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Placa para gotitas suspendidas.

Fragmento de la descripción:

Placa para gotitas suspendidas [0001] La presente invención se refiere a una placa para gotitas suspendidas de acuerdo con la reivindicación 5 independiente.

Se acepta en general que las células cultivadas en una configuración tridimensional son fisiológicamente más relevantes que las células en cultivos bidimensionales (monocapa) clásicos en una serie de aplicaciones y ensayos, por ejemplo en el descubrimiento de medicamentos o en los ensayos de toxicidad. Se ha 10 propuesto que las placas para gotitas suspendidas formen dichos agregados celulares tridimensionales. Se colocan gotas de un medio de cultivo de células con células suspendidas en un compartimento o pozo de cultivo de dicha placa, y a continuación se invierte la placa. Dado que no hay disponible ningún sustrato sobre el que se puedan adherir las células, éstas se acumulan en el vértice de la gotita suspendida y forman un agregado celular tridimensional. En caso de que se utilicen células madre embrionarias, éstas células madre se hunden hasta el vértice de la gotita, donde se encuentran para formar el agregado celular tridimensional, que se denomina un cuerpo embrioide.

Se muestra una placa para gotitas suspendidas que evita la necesidad de invertir la placa en el documento WO 2010/031194. La placa mostrada en esta referencia comprende un cuerpo de la placa, una primera y 20 una segunda superficies coplanarias, y una serie de conductos que penetran todo el cuerpo perpendicularmente desde la primera superficie (superior) hasta la segunda superficie (inferior) . El conducto comprende un compartimento de entrada en forma de embudo cerca de la primera superficie (superior) , un compartimento de cultivo en forma de embudo invertido próximo a la segunda superficie (inferior) , y una parte capilar dispuesta entre el compartimento de entrada y el compartimento de cultivo. Están dispuestas estructuras de relieve en forma de rebordes individuales que sobresalen desde la segunda superficie (inferior) del cuerpo y rodean cada compartimento de cultivo. Estos rebordes impiden que las gotitas se extiendan más allá de los rebordes.

La introducción del líquido que contiene las células en el compartimento de cultivo se realiza a través del compartimento de entrada y de la parte capilar. A modo de ejemplo, un medio de cultivo líquido que contiene 30 células madre se puede introducir de este modo en los compartimentos de cultivo, y la placa con las gotitas suspendidas puede ser incubada a continuación durante un intervalo de tiempo predeterminado, de tal modo que las células se agreguen para formar los cuerpos embrioides tridimensionales. En caso de que sea necesario suministrar medio de cultivo líquido nuevo después de algún tiempo, esto se lleva a cabo aspirando el medio de cultivo líquido "antiguo" a través del compartimento de entrada y de la parte capilar (por ejemplo, con la ayuda de una pipeta) y suministrando a continuación medio de cultivo líquido "nuevo" de la manera descrita anteriormente.

Si bien la placa descrita en el documento WO 2010/031194 es adecuada en general para cultivar células para formar agregados celulares tridimensionales, presenta margen para mejoras. Por ejemplo, para aspirar el medio de cultivo líquido antiguo a través del compartimento de entrada y de la parte capilar, se requiere un 40 dispositivo de aspiración (por ejemplo, una pipeta) que tiene que estar incorporado de modo que se ajuste fuertemente en las paredes del compartimento de entrada para efectuar una aspiración adecuada. Lo mismo se tiene para el suministro posterior de medio de cultivo líquido nuevo. Sin embargo, más importante aún es que la estabilidad de la gotita suspendida en el respectivo compartimento de cultivo es solamente limitada. Otro inconveniente es que el líquido se puede evaporar a una velocidad incontrolada a través del compartimento de 45 entrada abierto.

Por lo tanto, un objetivo de la invención es proponer una placa para gotitas suspendidas que supere los problemas mencionados anteriormente relacionados con la estabilidad de las gotitas suspendidas y con la evaporación del líquido. Además, el suministro adicional o la sustitución del medio de cultivo líquido debería ser fácil 50 de llevar a cabo.

Para conseguir el objetivo u objetivos mencionados anteriormente, la presente invención propone una placa para gotitas suspendidas, tal como se especifica mediante las características de la reivindicación independiente dirigida a dicha placa para gotitas suspendidas. Otras realizaciones de la placa para gotitas 55 suspendidas acorde con la invención son el objeto de las reivindicaciones dependientes.

En particular, la invención propone una placa para gotitas suspendidas que comprende un número predeterminado de compartimentos de gotita, cada uno de los cuales puede recibir una gotita de un líquido. El

compartimento de gotita respectivo comprende una barrera humectante microfluídica circunferencial dispuesta rodeando una cavidad respectiva y que impide que una gotita se extienda más allá de la barrera humectante microfluídica. Además, el compartimento respectivo comprende un fondo cerrado y por lo menos una barrera humectante microfluídica circunferencial adicional, estando dispuesta cada barrera humectante microfluídica circunferencial adicional para rodear una barrera humectante microfluídica circunferencial precedente, estando dispuesta un área humectable entre dos barreras humectantes microfluídicas dispuestas de manera adyacente.

La configuración de fondo cerrado de los compartimentos de cultivo conjuntamente con la barrera humectante circunferencial sirve para una mayor estabilidad de las gotitas suspendidas hacia abajo desde los respectivos compartimentos de cultivo, en particular en comparación con la placa para gotitas suspendidas mostrada en el documento WO 2010/031194, y se considera que esto se debe a la ausencia de acceso para aire en contraste con la placa para gotitas suspendidas del documento WO 2010/031194, en la que hay acceso para aire en el compartimento de entrada. Asimismo, debido a la ausencia de acceso para aire se reduce sensiblemente la evaporación del líquido.

Además, aunque es necesario volver a invertir la placa para gotitas suspendidas con el fin de suministrar una gotita de un medio de cultivo líquido adicional a la gotita ya contenida en el compartimento de cultivo para formar una gotita mayor, esto se puede realizar de manera fácil y cómoda. Esto se debe en primer lugar a la buena estabilidad de las gotitas, y se debe en segundo lugar a la barrera humectante microfluídica circunferencial adicional y al área humectable entre la barrera humectante microfluídica adicional y la barrera humectante microfluídica precedente, que permite el fácil suministro de una gotita adicional del medio de cultivo líquido. Se impide mediante dicha barrera microfluídica adicional que la gotita mayor así formada se extienda, de tal modo que se mantiene una buena estabilidad de la gotita mayor después de que la placa se vuelve a invertir a la configuración de gotitas suspendidas. En general, el número de barreras humectantes microfluídicas adicionales no está limitado, si bien en las realizaciones prácticas pueden estar presentes solamente una o dos barreras humectantes microfluídicas adicionales.

En una realización de la placa para gotitas suspendidas acorde con la invención, los compartimentos de gotita respectivos son pozos, mientras que en otra realización los compartimentos de gotita pueden estar formados mediante una superficie plana (rodeada mediante barreras humectantes microfluídicas, respectivamente) .

En otra realización de la placa para gotitas suspendidas acorde con la invención, la barrera humectante microfluídica circunferencial comprende un borde circunferencial... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) que comprende un número predeterminado de compartimentos de gotita (10; 30; 50; 60; 90) cada uno de los cuales puede recibir una gotita (20, 21; 40, 41, 42; 60, 61, 52, 63, 64) de un líquido, comprendiendo el respectivo compartimento de gotita (10; 30; 50; 60; 90) una barrera humectante microfluídica circunferencial (102; 302; 502; 702; 902) dispuesta para rodear una respectiva cavidad (100; 500) e impidiendo que una gotita se extienda más allá de la barrera humectante microfluídica, en el que el respectivo compartimento de gotita (10; 30; 50; 60; 90) comprende un fondo cerrado (101; 501) y por lo menos una barrera humectante microfluídica circunferencial adicional (104; 304, 306; 504, 506, 508, 510; 604, 606;

904, 906) , estando dispuesta cada barrera humectante microfluídica circunferencial adicional (104; 304, 306; 504, 506, 508, 510; 604, 606; 904, 906) para rodear una barrera humectante microfluídica circunferencial precedente (102; 302, 304; 502, 504, 506, 508; 604, 606; 904, 906) , estando dispuesta un área humectable (103; 303, 305; 503, 505, 507, 509) entre dos barreras humectantes microfluídicas dispuestas de manera adyacente.

2. Placa para gotitas suspendidas acorde con la reivindicación 1, en la que los respectivos compartimentos de gotita son pozos (10; 30; 60; 90) .

3. Placa para gotitas suspendidas acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la barrera humectante microfluídica circunferencial comprende un borde circunferencial (102) , y en la que dicha por lo menos una barrera humectante microfluídica circunferencial adicional comprende por lo menos un borde circunferencial adicional (104) , estando dispuesto cada borde circunferencial adicional (104) para rodear un borde circunferencial precedente (102) , estando dispuesta al área humectable (103) entre dos bordes circunferenciales dispuestos de manera adyacente (102, 104) .

4. Placa para gotitas suspendidas acorde con la reivindicación 3, en la que dos bordes circunferenciales adyacentes (102, 104) están dispuestos de manera escalonada.

5. Placa para gotitas suspendidas acorde con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la barrera humectante microfluídica circunferencial comprende un reborde circunferencial (302; 502; 602; 902) , y en la que dicha por lo menos una barrera humectante microfluídica adicional comprende un reborde circunferencial adicional, rodeando cada reborde circunferencial adicional (304, 306; 504, 506, 508, 510; 604, 606; 904, 906) un reborde circunferencial precedente (302, 304; 502, 504, 506, 508; 602, 604; 902, 904) , estando dispuesta el área humectable (303, 305; 503, 505, 507, 509) entre dos rebordes circunferenciales dispuestos de manera adyacente.

6. Placa para gotitas suspendidas acorde con la reivindicación 5, en el que los rebordes circunferenciales dispuestos de manera adyacente (302, 304, 306; 602, 604, 606; 902, 904, 906) están dispuestos de manera escalonada.

7. Placa para gotitas suspendidas (6; 9) acorde con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que la placa para gotitas suspendidas está realizada de una placa fabricada por separado (61; 91) que tiene un número predeterminado de orificios (610; 910) en la misma, y de un número predeterminado correspondiente de pozos fabricados por separado (60; 90) que forman los compartimentos de gotita, estando ajustado a presión cada pozo fabricado por separado (60; 90) en un orificio respectivo (610; 910) de la placa fabricada por separado (61; 91) .

8. Placa para gotitas suspendidas (6; 9) acorde con la reivindicación 7, en la que los pozos fabricados por separado (60; 90) están ajustados a presión en los orificios (610; 910) desde el lado de la placa (6; 9) que forma la superficie exterior (611, 911) de la placa (6; 9) .

9. Placa para gotitas suspendidas acorde con la reivindicación (7) o la reivindicación 8, que comprende 50 un número de 24 pozos, 96 pozos o 384 pozos.

10. Placa para gotitas suspendidas acorde con la reivindicación (5) , en la que los rebordes circunferenciales (503, 504, 506, 508, 510) están dispuestos sobre una superficie plana.

11. Un conjunto de placa para gotitas suspendidas, que comprende una placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) acorde con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que tiene un número predeterminado de pozos o compartimentos de gotita (10; 30; 50; 60, 90) , y una placa receptora (7) que tiene una serie de pozos (70) correspondiente al número predeterminado de pozos o compartimentos de gotita (10; 30; 50; 60; 90) de la placa 11

para gotitas suspendidas, estando montadas la placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) y la placa receptora (7) de tal modo que en la situación montada, los pozos (70) de la placa receptora están dispuestos alineados con los pozos o compartimentos de gotita (10; 30; 50; 60; 90) de la placa para gotitas suspendidas.

12. Procedimiento para examinar la toxicidad de una sustancia sobre las células, que comprende las etapas de:

a) introducir un número predeterminado de gotitas de líquido (20; 40; 64) en un número correspondiente de compartimentos de gotita (10; 30; 50; 60; 90) de una placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) , conteniendo cada gotita un volumen predeterminado de la sustancia examinar y de un medio de cultivo líquido, así como una serie de células (82) ; b) invertir e incubar la placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) durante un intervalo predeterminado de tiempo, conteniendo la placa para gotitas suspendidas las gotitas (20; 40; 64) , de tal modo que están suspendidas de los compartimentos de gotita respectivos (10; 30; 50; 60; 90) para permitir que las células (82) formen agregados celulares tridimensionales (83) en las respectivas gotitas (20; 40; 64) , c) suministrar medio de cultivo líquido adicional a las gotitas (20; 40; 64) en los compartimentos de gotita respectivos (10; 30; 50; 60; 90) para fomentar el crecimiento adicional de los agregados celulares tridimensionales (83) ; y d) analizar los agregados celulares tridimensionales (83) para determinar si la sustancia a examinar es tóxica para los agregados celulares tridimensionales (83) , en el que se utiliza una placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9)

acorde con cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y en el que la etapa c) se lleva a cabo volviendo a invertir la placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) , añadiendo una gotita del medio de cultivo líquido adicional a las respectivas gotitas que contienen los agregados celulares tridimensionales de tal modo que formen respectivas gotitas mayores (21; 41, 42; 65, 66, 67, 68) en los compartimentos de gotita respectivos (10; 30; 50; 60; 90) , y a continuación invirtiendo de nuevo la placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) para permitir que los agregados celulares tridimensionales (83) crezcan en las respectivas gotitas mayores (21; 41, 42; 65, 66, 67, 68) suspendidas de los compartimentos de gotita (10; 30; 50; 60; 90) .

13. Procedimiento acorde con la reivindicación 12, que comprende además las etapas de e) transmitir los agregados celulares tridimensionales cultivados (83) desde los compartimentos de gotita (10; 30; 50; 60; 90) de la placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) a un número correspondiente de pozos (70) de una placa receptora (7) ; f) incubar la placa receptora (7) con los pozos (70) que contienen los agregados celulares tridimensionales (83)

durante otro intervalo de tiempo predeterminado; y g) después de la incubación, analizar los agregados celulares tridimensionales para determinar si la sustancia a examinar es tóxica para los agregados celulares tridimensionales.

14. Procedimiento acorde con la reivindicación 13, en el que la etapa e) se lleva a cabo montando la placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) y la placa receptora (7) de tal modo que los pozos respectivos (70) de la placa receptora (7) estén dispuestos frente a los compartimentos de gotita respectivos (10; 30; 50; 60; 90) de la placa para gotitas suspendidas (1; 3; 5; 6; 9) , y mediante el centrifugado subsiguiente de las placas montadas.

15. Procedimiento acorde con cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que las células (82) son 45 células madre embrionarias y los agregados celulares tridimensionales (82) son cuerpos embrioides, y en el que la etapa de analizar los agregados celulares tridimensionales (83) para determinar si la sustancia a examinar es tóxica para los agregados celulares tridimensionales se lleva a cabo analizando si los cuerpos embrioides contienen células miocárdicas.