Nuevas variantes de proteína de cubierta E1 de rubéola y su utilización en la detección de anticuerpos anti-rubéola.

Antígeno E1 de rubéola que comprende los aminoácidos 201 a 432, con la condición de que dicho antígenono presente las secuencias correspondientes a los aminoácidos 143 a 164 y 454 a 481 del antígeno E1 de rubéolanativo y que contenga dos puentes disulfuro, en el que se forma un puente disulfuro entre Cys225 y Cys235

(C13-C14) y se forma un segundo puente disulfuro entre Cys349 y Cys352 (C17-C18).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/010532.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: FAATZ, ELKE, ENGEL, ALFRED, SCHOLZ, CHRISTIAN, UPMEIER, BARBARA, SCHAARSCHMIDT,PETER, Bollhagen,Ralf, Zarnt,Toralf.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)

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Fragmento de la descripción:

Nuevas variantes de proteína de cubierta E1 de rubéola y su utilización en la detección de anticuerpos anti-rubéola

Campo de la invención La invención se refiere a antígenos E1 de rubéola recombinantes y a variantes de los mismos. Los antígenos comprenden los aminoácidos 201 a 432 y se caracterizan porque no presentan por lo menos la región transmembranal C-terminal y el segmento de anclaje (aminoácidos 453 a 481) , así como por lo menos los aminoácidos 143 a 164. Los antígenos contienen además dos puentes disulfuro, es decir, contienen la región entre el puente disulfuro Cys225-Cys235 y Cys349-Cys352. La invención se refiere además a la producción de estos antígenos de doble puente disulfuro y a su utilización en un método de detección de anticuerpos anti-rubéola en sueros humanos. Es un objetivo importante en el desarrollo de los reactivos de antígeno para un inmunoensayo destinado a la detección de inmunoglobulinas proporcionar el máximo número posible de epítopos similares a los nativos estables. Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención es una composición que comprende por lo menos dos antígenos E1 de rubéola, cada uno de los cuales contiene por lo menos dos puentes disulfuro, en la que las combinaciones de puentes disulfuro en los diversos antígenos difieren entre sí.

Antecedentes de la invención El virus de la rubéola es el único miembro del género Rubivirus dentro de la familia Togaviridae. El virus, que es un virus ARN pequeño con cubierta (+) , es un patógeno humano y provoca una enfermedad infantil autolimitante leve (sarampión alemán o rubéola) caracterizada por prurito, linfoadenopatía y febrícula. Sin embargo, contraída en el primer trimestre del embarazo, puede causar muerte intrauterina del feto, aborto espontáneo o algunas anomalías asociadas al síndrome congénito de la rubéola. La tríada característica del síndrome congénito de la rubéola incluye cataratas, defectos cardiacos y sordera en el feto. Requiere programas de vacunación contra la rubéola y vigilancia del estado inmunológico de la mujer en edad fértil.

Las proteínas estructurales del virus de la rubéola se originan a partir de un único precursor polipéptido de 110 kDa, que es cortado proteolíticamente para rendir la proteína C de cápside y las proteínas de cubierta E2 y E1. E2 y E1 se encuentran glucosilados, forman heterodímeros no covalentes en la superficie del virión y son las dianas preferentes de la respuesta inmunológica humoral. El ectodominio anclado a membrana de la proteína E1, en particular, es inmunodominante y los anticuerpos contra E1 son abundantes en el suero de los individuos infectados por rubéola.

La proteína E1 de la rubéola, también denominada hemaglutinina de rubéola (ver la figura 1) , presumiblemente consiste de un ectodominio grande (residuos 1 a 452) , seguido de una única hélice transmembranal (residuos 453 a 468) y una cola citoplasmática corta (residuos 469 a 481) . Los residuos 438 a 452, que preceden inmediatamente a la región transmembranal, probablemente también forman una hélice. El ectodominio de E1 porta 20 residuos de cisteína, que se encuentran unidos en diez puentes disulfuro. Los pares de cisteínas C (1) -C (2) , C (3) -C (15) , C (6) C (7) , C (9) -C (10) , C (11) -C (12) , C (13) -C (14) , C (17) -C (18) y C (19) -C (20) pudieron confirmarse con certeza, mientras que el emparejamiento de los residuos de cisteína C (4) , C (5) , C (8) y C (16) sigue siendo ambiguo (Gros et al., Virology 230:179-186, 1997) . El ectodominio se encuentra glucosilado en las tres asparaginas 76, 177 y 209.

Se han realizado varios intentos en la técnica anterior para producir la proteína E1 de la rubéola con fines diagnósticos. Inicialmente, se aislaron a partir del sobrenadante de células renales de hámster recién nacido (BHK21) infectadas o de células Vero, fragmentos solubles de E1 para utilizarlos como antígenos en inmunoensayos. Posteriormente se desarrollaron diversos sistemas de expresión y secreción con el fin de producir versiones solubles e inmunorreactivas de E1 en huéspedes eucarióticos (Hobman et al., Virus Res. 31:277-289, 1994, y Seto et al., J. Med. Virol. 44:192-199, 1994) . Pudo producirse una forma glucosilada y soluble de E1 de longitud completa en Spodoptera frugiperda infectada por baculovirus (Seppänen et al., J. Clin. Microbiol. 29, 1877-1882, 1991, y Oker-Blom 1989, Virology 172:82-91) y en células CHO (Perrenoud et al. Vaccine 23:480-488, 2004) y, más recientemente, en Pichia pastoris (Wen y Wang, Intervirology 48:321-328, 2005) . La expresión de partículas similares de tipo rubéola en células BHK (Grangeot-Keros et al., J. Imm. Microbiol. 33:2392-2394) y en una línea celular CHO establemente transfectada (Giessauf et al., Arch. Virol. 150:2077-2090, 2005) rindió antígenos de rubéola adecuados para fines diagnósticos. Estas partículas de tipo rubéola eran aglomerados difusos no infecciosos de las proteínas C, E2 y E1 de rubéola unidas covalentemente, y resultaban útiles para detectar inmunoglobulinas de los tipos M y G.

Las formas no glucosiladas de E1 pudieron producirse, en principio, de manera mucho más eficiente en un huésped procariótico. En uno de los primeros intentos, se fusionó una versión de longitud completa y una versión truncada (207-353) de E1 de rubéola con la proteína A de Staphylococcus aureus y se produjeron en E. coli (Terr y et al., Arch. Virol. 104:63-75, 1989) . Estas proteínas de fusión eran activas como antígenos, pero no muy solubles y por lo

tanto de utilidad limitada para la detección específica de anticuerpos anti-E1. En general, las variantes de E1 de huéspedes procarióticos mostraban una fuerte tendencia a la agregación, posiblemente debido a que no se encontraban glucosiladas o por que se encontraban unidas incorrectamente mediante disulfuros. En fusión con la glutatión-S-transferasa, sólo pudieron expresarse en una forma soluble y funcional fragmentos pequeños de E1 que comprendían tan sólo 75 ó 44 residuos aminoácidos (Newcombe et al., Clinical and Diagnostic Virology 2:149-163, 1994, y Starkey et al., J. Clin. Microbiol. 33:270-274, 1995) . Pudieron obtenerse fragmentos de E1 más grandes, que comprendían 82 ó 171 residuos aminoácidos, al fusionarlos tanto con RecA como con º-galactosidasa (Wolinsky et al., J. Virol. 65, 3986-3994, 1991) .

El replegamiento oxidativo de las proteínas ricas en cisteína de gran tamaño, tales como E1, resulta muy difícil debido a que los intermediarios incorrectamente plegados con disulfuros erróneos, que resultan atrapados durante el replegamiento, presentan una tendencia muy elevada a la agregación. Por lo tanto, muchos esfuerzos se han concentrado en encontrar epítopos de células B contiguos a lo largo de la cadena del polipéptido E1 y en la utilización de los péptidos solubles cortos correspondientes a modo de antígenos en inmunoensayos. Los anticuerpos generalmente muestran afinidades modestas para los antígenos péptidos pequeños y, por lo tanto, sigue siendo un objetivo importante producir fragmentos estables y solubles de E1 de elevada antigenicidad y en grandes cantidades, idealmente mediante la producción masiva como cuerpos de inclusión en un huésped procariótico, seguido de un procedimiento robusto de renaturalización.

En Newcombe et al., supra, se utilizaron proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa (GST) y E1 para producir fragmentos de antígeno E1 de rubéola en E. coli en una forma soluble. Sin embargo, sólo tras un truncado sustancial de la secuencia de E1 resultó viable una expresión soluble de la región sin cisteínas 243-286 (44 residuos aminoácidos) . La solicitud de patente europea nº EP-A-0299673 da a conocer un péptido de residuos aminoácidos 207 a 353 que conserva las... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Antígeno E1 de rubéola que comprende los aminoácidos 201 a 432, con la condición de que dicho antígeno no presente las secuencias correspondientes a los aminoácidos 143 a 164 y 454 a 481 del antígeno E1 de rubéola nativo y que contenga dos puentes disulfuro, en el que se forma un puente disulfuro entre Cys225 y Cys235 (C13-C14) y se forma un segundo puente disulfuro entre Cys349 y Cys352 (C17-C18) .

2. Antígeno E1 de rubéola según la reivindicación 1, en el que dicho antígeno se produce en forma de una proteína de fusión recombinante.

3. Antígeno E1 de rubéola según la reivindicación 1, en el que dicho antígeno se fusiona con una chaperona de la clase de las peptidil-prolil-isomerasas.

4. Molécula de ADN recombinante codificante de un antígeno E1 de rubéola que comprende una secuencia de nucleótidos codificante del antígeno E1 de rubéola según la reivindicación 1.

5. Molécula de ADN recombinante codificante de un antígeno E1 de rubéola según la reivindicación 4, en el que cadena arriba del mismo se encuentra por lo menos una secuencia de nucleótidos codificante de una chaperona de la clase de las peptidil-prolil-isomerasas.

6. Vector de expresión que comprende operablemente ligada una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 4.

7. Célula huésped transformada con un vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Método para producir una proteína de fusión soluble e inmunorreactiva de antígeno E1 de rubéola, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

a) cultivar células huésped según la reivindicación 7, b) la expresión de dicha proteína de fusión, c) la purificación de dicha proteína de fusión, d) el replegamiento de dicha proteína de fusión en una conformación soluble e inmunorreactiva.

9. Método para la detección de anticuerpos específicos para rubéola en una muestra aislada, comprendiendo dicho método: a) formar una mezcla de inmunorreacción mediante la mezcla de una muestra de líquido corporal con un antígeno E1 de rubéola según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, b) mantener dicha mezcla de inmunorreacción durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los anticuerpos contra dicho antígeno E1 de rubéola presente en la muestra de líquido corporal inmunorreacione con dicho antígeno E1 de rubéola para formar un producto de inmunorreacción, y c) detectar la presencia de cualquiera de dichos productos de inmunorreacción.

10. Utilización de un antígeno E1 de rubéola según las reivindicaciones 1 a 3 en un método para la detección de anticuerpos contra rubéola en una muestra aislada.

11. Kit de reactivos para la detección de anticuerpos contra rubéola, que contiene un antígeno E1 de rubéola según las reivindicaciones 1 a 3.