Métodos de preparación de productos de expresión de proteínas de fusión modulares.

Una célula huésped recombinante que comprende un vector que comprende cada uno de los siguientes elementos dispuestos secuencialmente para formar un marco de lectura abierto modular, comprendiendo dicho vector:

a) un primer sitio de restricción que codifica para un primer grupo de aminoácidos, comprendiendo el primer grupo de aminoácidos al menos dos aminoácidos,

b) un primer marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido de interés, en el que la secuencia codificante del polipéptido de interés está en marco con la secuencia codificante de al menos dos aminoácidos del primer sitio de restricción,

c) un segundo sitio de restricción que codifica para un segundo grupo de aminoácidos, comprendiendo el segundo grupo de aminoácidos al menos dos aminoácidos, en el que la secuencia codificante del segundo grupo de aminoácidos del segundo sitio de restricción está en marco con la secuencia codificante del polipéptido de interés del primer marco de lectura abierto, y en el que la secuencia polinucleotídica del segundo sitio de restricción no es la misma que la secuencia polinucleotídica del primer sitio de restricción, d) una secuencia polinucleotídica espaciadora, codificando la secuencia polinucleotídica espaciadora para al menos tres aminoácidos espaciadores, y en la que la secuencia codificante para la secuencia espaciadora está en marco con la secuencia polinucleotídica del segundo sitio de restricción, y

e) un tercer sitio de restricción que codifica para un tercer grupo de aminoácidos, comprendiendo el tercer grupo de aminoácidos al menos dos aminoácidos, en el que la secuencia codificante del tercer grupo de aminoácidos del tercer sitio de restricción está en marco con la secuencia codificante de los al menos tres aminoácidos espaciadores y en el que la secuencia polinucleotídica del tercer sitio de restricción no es la misma que la secuencia polinucleotídica del primer sitio de restricción y el tercer sitio de restricción no es el mismo que la secuencia polinucleotídica del segundo sitio de restricción;

3 0 en el que los elementos

(a) a (e) están unidos en marco entre sí para formar el marco de lectura abierto modular, en el que el primer sitio de restricción es susceptible a una enzima de restricción que producirá una primera proyección monocatenaria que comprende al menos 2 nucleótidos, en el que el segundo sitio de restricción es susceptible a una enzima de restricción que producirá una segunda proyección monocatenaria que comprende al menos 2 nucleótidos, en el que dichas proyecciones primera y segunda son complementarias entre sí, y en el que tras el apareamiento de las proyecciones primera y segunda, se destruyen el primer sitio de restricción y el segundo sitio de restricción.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11170207.

Solicitante: INTREXON CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1750 Kraft Drive, Suite 1400 Blacksburg, VA 24060 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: REED,THOMAS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N1/00 (Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/20 (Bacterias; Sus medios de cultivo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/47 (de mamíferos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/12 (transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N15/00 (Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/64 (que provienen de tejido animal, p. ej. renina)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/48 (actúan sobre los enlaces peptídicos, p. ej. tromboplastina, aminopeptidasa de la leucina (3.4))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/49 (Uroquinasa; Activador de plasminógeno)

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Fragmento de la descripción:

Mïtodos de preparaciïn de productos de expresiïn de proteïnas de fusiïn modulares

Campo de la invenciïn La invenciïn se refiere a cïlulas huïsped recombinantes.

Esta solicitud tiene contenido relacionado con las solicitudes n.os 60/728, 259, 60/803, 913, 60/821, 682, 60/821, 958, 10/682, 764 (US 2004/0185556, PCT/US2004/013517, WO 2005/040336) 11/233, 246 y US 20040572011 P (documento WO2005/116231) .

Antecedentes y tïcnica anterior

Se conocen en la tïcnica tecnologïas de ADN recombinante y mïtodos de biologïa molecular de clonaciïn de ïcidos nucleicos. Tales mïtodos incluyen la manipulaciïn de ïcidos nucleicos usando endonucleasas de restricciïn, ligasas, nucleïtido/nucleïsido cinasas y fosfatasas, polimerasas y otras herramientas de biologïa molecular para generar ïcidos nucleicos recombinantes deseados. Se han escrito varios manuales de laboratorio como libros de referencia para investigadores de biologïa molecular. Los ejemplos de estos manuales de referencia incluyen Sambrook, J., E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989. Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 2ï. ed. Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laborator y Press; y Joseph Sambrook y David Russell, 2001. Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 3ï ed. Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laborator y Press.

Un problema en la tïcnica es la falta de metodologïa para diseïar por ingenierïa genïtica productos de expresiïn de proteïnas quimïricas en los que puedan insertarse fïcilmente elementos modulares en posiciones deseadas dentro de una quimera. En general, aunque se han preparado satisfactoriamente proteïnas hïbridas o quimïricas, el objetivo de la sïntesis ha sido hacia productos terminales finales, sin la incorporaciïn de un mecanismo predeterminado para aïadir mïs mïdulos. Un aspecto de la descripciïn aborda este problema contemplando la necesidad futura de quimeras y variaciones de las mismas y haciendo posible construirlas sin comenzar desde cero para cada una. Una realizaciïn de la descripciïn se refiere en general a mïtodos de preparaciïn de productos de expresiïn de proteïnas de fusiïn. Otra realizaciïn de la descripciïn se refiere a mïtodos de preparaciïn de productos de expresiïn de proteïnas de fusiïn con mïdulos diseïados previamente por ingenierïa genïtica. Otro aspecto de la descripciïn se refiere a mïdulos o molïculas de bloques de construcciïn, diseïïndose previamente los mïdulos para que puedan insertarse en un casete de expresiïn de proteïnas quimïricas. La presente descripciïn tambiïn contempla bibliotecas de mïdulos diseïados por ingenierïa genïtica que pueden utilizarse en los mïtodos dados a conocer. En una realizaciïn, se preparan mïdulos con sitios de restricciïn predeterminados.

Descripciïn detallada de secuencias polipeptïdicas y polinucleotïdicas La SEQ ID NO: 1 es un ejemplo de un mïdulo de ïcido nucleico. El mïdulo tiene la estructura 5’ - 3’ de: 5’-sitio de restricciïn predeterminado-marco de lectura abierto (ORF) de polipïptido de interïs-sitio de restricciïn predeterminado-fragmento de relleno-sitio de restricciïn predeterminado-3’. Los sitios de restricciïn predeterminados y el fragmento de relleno tambiïn codifican para aminoïcidos en mamïferos y estïn en marco con el polipïptido de interïs, por tanto todo el mïdulo es un marco de lectura abierto compuesto. La SEQ ID NO: 1 se 45 representa en la figura 11.

La SEQ ID NO: 2 es el polipïptido codificado por la SEQ ID NO: 1.

Breve descripciïn de los dibujos La figura 1 muestra un mïtodo para construir proteïnas de fusiïn en una direcciïn de extremo N-terminal a extremo C-terminal, utilizando dos reactivos de partida de ADN circular.

La figura 2 muestra un mïtodo para construir proteïnas de fusiïn en una direcciïn de extremo C-terminal a extremo 55 N-terminal, utilizando dos reactivos de partida de ADN circular.

La figura 3 muestra un mïtodo para construir proteïnas de fusiïn en una direcciïn de extremo N-terminal a extremo C-terminal, utilizando un reactivo de partida de ADN circular y un reactivo de partida de ADN lineal.

La figura 4 muestra un mïtodo para construir proteïnas de fusiïn en una direcciïn de extremo N-terminal a extremo C-terminal, utilizando dos reactivos de partida de ADN lineal.

La figura 5 muestra un mïtodo recursivo para construir proteïnas de fusiïn en una direcciïn de extremo N-terminal a extremo C-terminal.

Las figuras 6A-6C muestran ejemplos de polipïptidos quimïricos en los que se derivan mïdulos de partes de exones.

Las figuras 7A-7C muestran ejemplos de polipïptidos quimïricos en los que un mïdulo contiene una seïal de localizaciïn. 5 Las figuras 8A-8C muestran ejemplos de proteïnas de fusiïn en los que un mïdulo contiene una etiqueta de epïtopo.

Las figuras 9A-9C muestran ejemplos de proteïnas de fusiïn en los que los mïdulos contienen diferentes dominios funcionales.

La figura 10 muestra un casete de expresiïn de ejemplo que contiene una secuencia que codifica para proteïna quimïrica preparado segïn los mïtodos de la descripciïn.

La figura 11 muestra un mïdulo de ejemplo que contiene un marco de lectura abierto de interïs (ORF) flanqueado 15 por sitios de restricciïn predeterminados y un fragmento de relleno.

La figura 12 muestra un ejemplo de una biblioteca de mïdulos ïtiles en la descripciïn. Los miembros de la biblioteca tienen sitios de restricciïn predeterminados idïnticos indicados como Sitio I, Sitio II y Sitio III. Los marcos de lectura abiertos no estïn dibujados a escala, y por tanto pueden variar en longitud. En una realizaciïn, los miembros de la biblioteca estïn contenidos dentro del ADN de vector. En una realizaciïn, el vector es un plïsmido circular.

La figura 13 muestra un mïtodo de preparaciïn de proteïnas de fusiïn mediante sïntesis combinatoria dinïmica. Las abreviaturas en esta figura son tal como sigue: N4 representa NgoM IV; X1 representa Xma I; C1 representa Cla I; dir significa directo; inv significa inverso; V representa sitios NgoM IV y Xma I vestigiales.

Las figuras 14A-14D muestran ejemplos de vectores que contienen constructos gïnicos de polipïptidos quimïricos, modulares.

Breve descripciïn de la invenciïn La presente invenciïn proporciona una cïlula huïsped recombinante que comprende un vector que comprende cada uno de los siguientes elementos dispuestos secuencialmente para formar un marco de lectura abierto modular, comprendiendo dicho vector:

a) un primer sitio de restricciïn que codifica para un primer grupo de aminoïcidos, comprendiendo el primer grupo de aminoïcidos al menos dos aminoïcidos,

b) un primer marco de lectura abierto que codifica para un polipïptido de interïs, en el que la secuencia codificante del polipïptido de interïs estï en marco con la secuencia codificante de al menos dos aminoïcidos del primer sitio de restricciïn,

c) un segundo sitio de restricciïn que codifica para un segundo grupo de aminoïcidos, comprendiendo el segundo grupo de aminoïcidos al menos dos aminoïcidos, en el que la secuencia codificante del segundo grupo de aminoïcidos del segundo sitio de restricciïn estï en marco con la secuencia codificante del polipïptido de interïs 45 del primer marco de lectura abierto, y en el que la secuencia polinucleotïdica del segundo sitio de restricciïn no es la misma que la secuencia polinucleotïdica del primer sitio de restricciïn,

d) una secuencia polinucleotïdica espaciadora, codificando la secuencia polinucleotïdica espaciadora para al menos tres aminoïcidos espaciadores, y en el que la secuencia codificante para la secuencia espaciadora estï en marco... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una cïlula huïsped recombinante que comprende un vector que comprende cada uno de los siguientes elementos dispuestos secuencialmente para formar un marco de lectura abierto modular, comprendiendo dicho 5 vector:

a) un primer sitio de restricciïn que codifica para un primer grupo de aminoïcidos, comprendiendo el primer grupo de aminoïcidos al menos dos aminoïcidos,

b) un primer marco de lectura abierto que codifica para un polipïptido de interïs, en el que la secuencia codificante del polipïptido de interïs estï en marco con la secuencia codificante de al menos dos aminoïcidos del primer sitio de restricciïn,

c) un segundo sitio de restricciïn que codifica para un segundo grupo de aminoïcidos, comprendiendo el segundo grupo de aminoïcidos al menos dos aminoïcidos, en el que la secuencia codificante del segundo grupo de aminoïcidos del segundo sitio de restricciïn estï en marco con la secuencia codificante del polipïptido de interïs del primer marco de lectura abierto, y en el que la secuencia polinucleotïdica del segundo sitio de restricciïn no es la misma que la secuencia polinucleotïdica del primer sitio de restricciïn,

d) una secuencia polinucleotïdica espaciadora, codificando la secuencia polinucleotïdica espaciadora para al menos tres aminoïcidos espaciadores, y en la que la secuencia codificante para la secuencia espaciadora estï en marco con la secuencia polinucleotïdica del segundo sitio de restricciïn, y

e) un tercer sitio de restricciïn que codifica para un tercer grupo de aminoïcidos, comprendiendo el tercer grupo de aminoïcidos al menos dos aminoïcidos, en el que la secuencia codificante del tercer grupo de aminoïcidos del tercer sitio de restricciïn estï en marco con la secuencia codificante de los al menos tres aminoïcidos espaciadores y en el que la secuencia polinucleotïdica del tercer sitio de restricciïn no es la misma que la secuencia polinucleotïdica del primer sitio de restricciïn y el tercer sitio de restricciïn no es el mismo que la secuencia polinucleotïdica del segundo sitio de restricciïn;

en el que los elementos (a) a (e) estïn unidos en marco entre sï para formar el marco de lectura abierto modular,

en el que el primer sitio de restricciïn es susceptible a una enzima de restricciïn que producirï una primera proyecciïn monocatenaria que comprende al menos 2 nucleïtidos, en el que el segundo sitio de restricciïn es susceptible a una enzima de restricciïn que producirï una segunda proyecciïn monocatenaria que comprende al menos 2 nucleïtidos,

en el que dichas proyecciones primera y segunda son complementarias entre sï, y

en el que tras el apareamiento de las proyecciones primera y segunda, se destruyen el primer sitio de restricciïn y el segundo sitio de restricciïn.

2. La cïlula huïsped recombinante de la reivindicaciïn 1, en la que los elementos estïn dispuestos en una direcciïn de 5’ a 3’, en la que el elemento (a) estï en el extremo 5’ del vector. 45

3. La cïlula huïsped recombinante de la reivindicaciïn 1, en la que los elementos estïn dispuestos en una direcciïn de 3’ a 5’, en la que el elemento (a) estï en el extremo 3’ del vector.

4. La cïlula huïsped recombinante de la reivindicaciïn 1, en la que el polipïptido de interïs estï seleccionado del

grupo que consiste en una proteïna o un polipïptido de longitud completa, un dominio funcional de proteïna, un dominio estructural de proteïna, un dominio enzimïtico de proteïna, un dominio de inhibiciïn de proteïna, un dominio de uniïn de proteïna, un dominio de localizaciïn de proteïna, y un epïtopo.

5. La cïlula huïsped recombinante de la reivindicaciïn 4, en la que dicho polipïptido de interïs es un dominio de 55 localizaciïn de proteïna.