Método para introducir ARNip en células mediante internalización fotoquímica.

Un método in vitro o ex vivo para introducir una molécula de ARNip en el citosol de una célula, comprendiendo dicho método

i) poner en contacto dicha célula con una molécula de ARNip, un vehículo y un agente fotosensibilizador, y

ii) irradiar la célula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en donde dicho vehículo comprende una poliamina catiónica seleccionada de

(a) una lipopoliamina en una formulación no liposomal, en donde preferiblemente la lipopoliamina contiene grupos amina primaria y secundaria, o una mezcla de los mismos y/o en donde preferiblemente la región de poliamina de la lipopoliamina tiene al menos 2 átomos de nitrógeno y una carga de al menos +1 a pH fisiológico,

(b) una polietilenimina (PEI),

(c) un polímero de betaciclodextrina-amina de fórmula

en donde X es un número entero de 1 a 100 inclusive, y n es un número entero de 4 a 10 inclusive,

(d) un dendrímero que contiene un grupo amina, y

(e) un péptido catiónico,

en donde dicha célula preferiblemente es de mamífero y/o dicha molécula de ARNip preferiblemente es de 12-28 nucleótidos de longitud y/o preferiblemente se usa ARNip 10 nM - 200 nM para la transfección.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2007/002569.

Solicitante: PCI BIOTECH AS.

Nacionalidad solicitante: Noruega.

Dirección: Strandveien 55 1366 Lysaker NORUEGA.

Inventor/es: BØE,SIGURD, HOVIG,EIVIND JOHANNES.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/11 (Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/87 (Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/113 (Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido)

PDF original: ES-2525222_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Método para introducir ARNip en células mediante internalización fotoquímica Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para introducir un ARN interferente pequeño (ARNip) en células, preferiblemente en el cltosol de células, usando un agente fotosensibilizador y una molécula vehículo e irradiación de las células con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y al uso de este método para alterar la actividad génlca, p. ej., sllenciamiento de genes in vitro o in vivo.

El proceso de Interferencia del ARN se produce en muchos organismos y en este proceso ARN bicatenario no codificante silencia la expresión génlca en una secuencia específica, de forma postranscripcional. En la naturaleza, el fenómeno protege el genoma de un organismo de ácidos nucleicos extraños invasores tales como transposones, transgenes y genes víricos.

La introducción de ARN bicatenario (ARNbc) en una célula provoca este proceso de silenciamiento de ARN y cualquier ARNm en la célula que corresponda en secuencia con el ARNbc introducido es degradado. Las rutas de silenciamiento de ARN Implican la conversión de ARNbc en ARN interferentes pequeños (ARNip) que dirigen las ribonucleasas a ARNm homólogos diana. La enzima Dicer procesa el ARNbc en ARNip, que en general tienen 2-25 nucleótidos de longitud. Después los ARNip se ensamblan en complejos que contienen endorribonucleasa conocidos como complejos de silenciamiento inducidos por ARN (RISC) que son guiados a moléculas de ARN complementario, donde escinden y destruyen el ARNm diana. Pequeñas cantidades de ARNbc pueden silenciar una gran cantidad de ARNm diana debido a un componente de amplificación del silenciamiento con ARN (revisado en Hannon y Rossl (24), Nature 431, 371-378).

El conocimiento de que las moléculas de ARNip son componentes clave de la ruta, condujo al ensayo de moléculas de ARNip químicamente sintetizadas de aproximadamente 2 a 22 pares de bases de longitud, correspondientes a las secuencias de ARN o ADN diana. Se mostró que estas moléculas actúan para alterar la expresión de las secuencias diana en células de mamífero (Elbashir S.M. et al., (21) Nature 411, 494-498). Un ARNip de 2 nucleótidos normalmente es suficientemente largo para inducir el silenciamiento específico de genes, pero suficientemente corto para eludir una respuesta del hospedante. La disminución de la expresión de los productos génlcos diana puede ser extensa con 9% de silenciamiento Inducido por algunas moléculas de ARNip.

Por lo tanto, la tecnología del ARNip se ha desarrollado como una técnica general para el silenciamiento de genes de secuencia específica. El silenciamiento de genes tiene muchas aplicaciones, tanto ¡n vitro como ¡n vivo, tanto como una herramienta de investigación como una estrategia terapéutica. La gran potencia y especificidad que se ve cuando se usa la tecnología del ARNip hace que esta tecnología sea particularmente atractiva.

En todos los casos, el suministro de moléculas de ARNip a las células representa un desafío importante, ya que para que se produzca el silenciamiento génico, es necesario que las moléculas de ARNip entren en las células en concentraciones suficientes para ser útiles. La fuerza de la respuesta del silenciamiento y su duración están afectadas por la cantidad de ARNip que es suministrado a la célula, y se ha mostrado que suministrando ARNip en concentraciones suficientemente altas, incluso una molécula de ARNip relativamente débil puede silenciar su diana. Sin embargo, esto debe estar equilibrado frente al hecho de que se sabe que la administración de cantidades grandes de ARNip en una célula puede conducir a efectos no deseados tales como efectos "inespecíficos" (es decir, cambios no deseados en los niveles de expresión de proteínas) o la activación de rutas ¡nmunitarias innatas.

En general, el ARNip se ha aplicado a células usando protocolos de transfección convencionales para ácidos nucleicos, tales como usando liposomas, lípidos catiónicos, lípidos aniónicos y microinyección. El ARNip es una molécula bicatenaria y como tal, el suministro y la absorción celular de la molécula es más difícil que para la cadena no codificante, que se une a proteínas del suero que son absorbidas por las células. Se han usado varias estrategias diferentes y existen kits disponibles en el comercio para este propósito. Como se ha indicado antes, la transfección eficaz es muy conveniente, puesto que la potencia del silenciamiento génico depende al menos en parte de la concentración de ARNip en la célula, para la administración a las células en concentraciones altas puede producir efectos secundarios Indeseables.

La administración en niveles altos a menudo requiere concentraciones altas de reactivos de transfección, y esto puede tener efectos adversos en las células incluyendo la viabilidad celular reducida y varios otros efectos secundarios, tanto fenotípicos como no fenotípicos. Además, cuando se usan concentraciones altas de reactivos, no se logra el suministro específico.

El suministro dirigido de moléculas de ácido nucleico tales como ARNip, en general, no es tampoco suficientemente fiable. Se pueden usar virus para este propósito, sin embargo, hay problemas de seguridad con este procedimiento y el suministro vírico slstémico es difícil de lograr.

El ARNip actúa en el citosol de las células, y es necesario que la molécula alcance el citosol para que actúe. En vista de las consideraciones anteriores, sería conveniente desarrollar un método mejorado de suministro de ARNip en

citosol de una célula. Las propiedades deseables de dicho método mejorado incluyen, i) la capacidad para generar el suministro específico de tiempo y de sitio de las moléculas de ARNip en su sitio de acción, ii) evitar el uso de concentraciones altas de reactivo de transfección y/o ARNip, y/o iii) ARNip potenciado de silenciamiento en líneas celulares. En particular, dichos métodos reducirían el número total de complejos de ARNip:lípido necesarios para lograr un determinado nivel de silenciamiento génico o mejorarlo. En dichos métodos, la relación de ARNip:reactivo de transfección se puede alterar mientras se mantiene una determinada cantidad de silenciamiento génico o se mejora. El aumento de la relación de ARNIp:lípido es útil puesto que minimizaría los efectos inhibidores que se observan cuando se usan concentraciones altas de reactivos de transfección.

El objetivo general del método mejorado se puede exponer de forma alternativa como un deseo de equilibrar la necesidad del suministro de ARNip eficaz y controlable al citosol, con reducción de efectos secundarios adversos causados por concentraciones altas de reactivos de transfección, o efectos no específicos, p. ej., en tipos de células particulares. Como se ha Indicado antes, la reducción del número general de complejos de ARNip:lípido y/o un aumento en la relación de ARNIp:lípldo, contribuirían a este objetivo.

Con el fin de lograr estos objetivos, los autores de la invención han combinado el uso de un vehículo (reactivo de transfección) con la técnica de la ¡nternallzaclón fotoquímica (PCI). El vehículo particular que se elige suministra la molécula de ARNip en los compartimentos ¡ntracelulares de la célula, p. ej., vesículas endocíticas tales como el endosoma y/o el lisosoma de la célula. Los compartimentos ¡ntracelulares alternativos en los que el complejo de ARNIp:lípldo puede ser absorbido Incluyen el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico.

La liberación de la molécula de ARNip de la vesícula intracelular se produce como una consecuencia de la técnica de PCI. Esto depende de la exposición de la célula a un compuesto fotosensibilizador y posterior... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1.- Un método in vitro o ex vivo para introducir una molécula de ARNip en el citosol de una célula, comprendiendo dicho método

i) poner en contacto dicha célula con una molécula de ARNip, un vehículo y un agente fotosensibilizador, y

ii) irradiar la célula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador,

en donde dicho vehículo comprende una poliamina catiónica seleccionada de

(a) una lipopoliamina en una formulación no liposomal, en donde preferiblemente la lipopoliamina contiene grupos amina primaria y secundaria, o una mezcla de los mismos y/o en donde preferiblemente la región de poliamina de la lipopoliamina tiene al menos 2 átomos de nitrógeno y una carga de al menos +1 a pH fisiológico,

(b) una polietilenimina (PEI),

(c) un polímero de betaciclodextrina-amina de fórmula

**(Ver fórmula)**

en donde X es un número entero de 1 a 1 inclusive, y n es un número entero de 4 a 1 inclusive, 15 (d) un dendrímero que contiene un grupo amina, y

(e) un péptido catiónico,

en donde dicha célula preferiblemente es de mamífero y/o dicha molécula de ARNip preferiblemente es de 12-28 nucleótidos de longitud y/o preferiblemente se usa ARNip 1 nM -2 nM para la transfección.

2.- El método de la reivindicación 1, en donde la región de poliamina de la lipopoliamina preferiblemente tiene 2 la fórmula (I)

**(Ver fórmula)**

en la que

m es un número entero mayor o igual que 2 y n es un número entero mayor o igual que 1, en donde m puede ser el mismo o diferente cuando aparece en dicha fórmula, en cada posición Rf es hidrógeno o un grupo de conexión con 25 la parte lipo de la lipopoliamina, o la propia parte lipo, y pueden ser iguales o diferentes en cada átomo de carbono,

R2 es un hidrógeno o un grupo de conexión con la parte lipo de la lipopoliamina o la propia parte lipo,

en donde solo uno de R1 y R2 es un grupo de conexión con la parte lipo de la lipopoliamina, o la propia parte lipo, y en donde cuando R1 o R2 es el grupo de conexión unido a dicha parte lipo o la propia parte lipo, la fórmula (I) es dicha lipopoliamina, en donde preferiblemente m es entre 2 y 6 inclusive y n es entre 1 y 5, en especial 3 preferiblemente n es 3, y/o preferiblemente R2 es H.

3.- El método de la reivindicación 2, en donde la región de poliamina está representada por la siguiente fórmula

RZHN-

H

-C-

H

-C-

H

-C-

H

-N-

H

C-

H

-C-

R

la

Rlb R

le

R1

H

-C-

H

-C-

H

-N-

-CH-

H H -C------C-

NH,

Id le Rlf Rlg

R

Ui

Ru R*J

en donde de R1a a R1j son como se ha definido R1 en la reivindicación 2, en donde preferiblemente R1a es un conector y el resto de los grupos R1 son hidrógeno.

4.- El método de la reivindicación 2 o 3, en donde R1 o R2 representan (i) un átomo de hidrógeno o (ii) un radical de fórmula general II:

**(Ver fórmula)**

R5

en la que

R3 y R4, que pueden ser ¡guales o diferentes, cada uno representa un radical alifático saturado CpH2P+2 o radical alifático insaturado CpH2p o CpH2p-2, siendo p un número entero entre 12 y 22 inclusive, y

R5 representa un átomo de hidrógeno o un radical alquilo que contiene de 1 a 4 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con un radical fenilo.

con la condición de que solo uno de R1 y R2 puede representar un radical de fórmula general (II), o (iii) un radical de fórmula general III:

R6------X------O-----CH2

R7------X------O-----CH O

H2 H2 h O

H2C------O------P-------O------C -----C -----N-------c

OH

en la que

X representa un grupo metileno (-CH2-) o un grupo carbonilo (-CO-), y R6 y R7, que pueden ser iguales o diferentes, representa cada uno un radical alifático saturado CPH2p+2 o radical alifático insaturado Cp H2p' o Cp H2p.2, siendo p un número entero entre 11 y 21 inclusive.

con la condición de que solo uno de R1 y R2 puede representar un radical de fórmula general (III).

5.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde

(a) n es un número entero entre 2 y 5 inclusive, y los valores de m en los diferentes fragmentos

------(CH)ra

A.1

son iguales o diferentes, o

(b) n es igual a 3 y los valores de m en los fragmentos son iguales o diferentes, y representan 3 o 4, y R1 o R2 representan:

(i) un radical de fórmula general (II) en el que R3 y R4 representa cada uno un radical alquilo que contiene

de 12 a 22 átomos de carbono y R^ representa un átomo de hidrógeno, o

(¡i) un radical de fórmula general (III) en la que Rs-X- y R7-X- representa cada uno un radical alcanoilo que contiene de 12 a 22 átomos de carbono.

6.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la región lipófila de dicha lipopoliamina es cualquier cadena hidrocarbonada saturada o insaturada, colesterol u otro esteroide, un lípido natural o un lípido sintético capaz de formar fases laminares o hexagonales, en donde preferiblemente la longitud de la cadena hidrocarbonada es de 1 a 3 carbonos de longitud.

7.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la lipopoliamina se selecciona de 5- carboxiespermilglicinadioctadecilamida (DOGS), 5-carboxiespermilamida de la dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES), trifluoracetato de 2,3-dioleil-oxi-N-[2-esperminacarboxil-amido]etil-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), 1,3-dioleoiloxi-2-(6-carboxiespermina)propilamida (DOSPER) y RPR-12535.

8.- El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el vehículo es JetSI, JetSI-ENDO o Transfectam®.

9.- El método de la reivindicación 1, en donde el vehículo es una molécula de dendrímero de PAMAM.

1.- El método de la reivindicación 9, en donde la molécula de dendrímero de PAMAM es una molécula de

dendrímero de PAMAM de generación 2-6.

11.- El método de la reivindicación 1, en donde el vehículo es una molécula de PEI ramificada, en donde preferiblemente el peso molecular de la PEI es menor que 5 kDa.

12.- El método de la reivindicación 1, en donde el vehículo es una molécula de PEI con un peso molecular menor que 3 kDa.

13.- El método de la reivindicación 11 o 12, en donde el peso molecular de la PEI es menor o igual a 25 kDa.

14.- El método de la reivindicación 1, en donde el vehículo es polihistidina, poliarginina, polilisina histidilada y

poliornitina, o un copolímero de restos de L o D lisina, L o D arginina, L o D histidina y/u ornitina con uno o más de otros aminoácidos.

15.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el agente fotosensibilizador se selecciona de una porfirina, ftalocianina, purpurina, clorina, benzoporfirina, base débil lisosomotrópica, naftalocianina, colorante catiónico, tetraciclina, ácido 5-aminolevulínico y/o ésteres de los mismos, o un derivado de cualquiera de dichos agentes, o sus sales farmacéuticamente aceptables.

16.- El método de la reivindicación 15, en donde el agente fotosensibilizador se selecciona de TPPS4, TPPS2a, AIPcS2a, TPCS2a, ácido 5-aminolevulínico y/o ésteres de ácidos 5-aminolevulínico, o sus sales farmacéuticamente aceptables.

17.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que además comprende la etapa adicional de poner en contacto dicho ARNip con dicho vehículo, en donde preferiblemente el ARNip se mezcla con el vehículo de modo que se forme un complejo, el cual después se administra a la célula simultánea o secuencialmente con el agente fotosensibilizador, en donde en especial preferiblemente la molécula de ARNip y la molécula vehículo se ponen en contacto entre sí durante 2-4 min antes de ponerlos en contacto con la célula.

18.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde está adicionalmente presente un vehículo fotosensibilizador seleccionado de un policatión, polietilenimina, un dendrímero, un lípido catiónico y un péptido.

19.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde dicho método se lleva a cabo poniendo en contacto dicha célula con un agente fotosensibilizador, poniendo en contacto dicha célula con el vehículo y la molécula de ARNip que se va a introducir e irradiando dicha célula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en donde dicha irradiación se lleva a cabo antes de la absorción celular de dicha molécula de ARNip y dicho vehículo en un compartimento intracelular que contiene dicho agente fotosensibilizador, preferiblemente antes de la absorción celular de dicha molécula y dicho vehículo en cualquier compartimento intracelular.

2.- Un método in vitro o ex vivo de inhibición de la expresión de un gen diana mediante la introducción de una molécula de ARNip en una célula que contiene dicho gen diana, por un método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde dicha molécula de ARNiP inhibe específicamente la expresión de dicho gen diana.

21.- Una composición o kit que contiene una molécula de ARNip y una molécula vehículo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y un agente fotosensibilizador como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

22.- La composición de la reivindicación 21, para usar en terapia.

23- Un producto que contiene una molécula de ARNIp y una molécula vehículo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y un agente fotosenslbilizador como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para el uso simultáneo, separado o secuencial en terapia.

24.- Una composición o producto como se define en la reivindicación 22 o 23, o una célula o una población de 5 células, que contiene una molécula de ARNIp que se ha Internalizado en el cltosol de dicha célula, cuya célula se puede obtener por un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección, alterando la expresión de uno o más genes diana en dicho paciente, en donde preferiblemente dicha enfermedad o trastorno se caracteriza por la expresión génica anormal o se beneficiaría de la supresión de uno o más genes.

25.- La composición o producto o célula o población de células, que contiene una molécula de ARNip que se ha

internalizado en el cltosol de dicha célula, para usar según la reivindicación 24, en donde dicha enfermedad o trastorno es cáncer.

26.- El uso de una composición o producto como se define en la reivindicación 22 o 23, o una célula, o una población de células, que contiene una molécula de ARNip que se ha internalizado en el citosol de dicha célula, cuya

célula se puede obtener por un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección, alterando la expresión de uno o más genes diana en dicho paciente, en donde preferiblemente dicha enfermedad o trastorno se caracteriza por la expresión génica anormal o se beneficiaría de la supresión de uno o más genes, preferiblemente cáncer.