Fructosil peptidil oxidasa y un sensor para analizar una proteína glucosilada.

La utilización de fructosil peptidil oxidasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se indica en el Id. de Sec. Nº:1 y que posee un valor de Km frente a la fructosil valil histidina de 1 mM o inferior para determinar una proteína glucosilada en una muestra en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP

(metilsulfato de 1-metoxi-5- metilfenazinio/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 (clorhidrato de N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 1008 (N,N-bis-hidroxi-etil-4-nitrosoanilina) o NN- 4-dimetil-nitrosoanilina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2010/004707.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: GRENZACHERSTRASSE 124 4070 BASEL SUIZA.

Inventor/es: SODE,KOJI, IKEBUKURO,KAZUNORI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > C12Q1/00 (Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/72 (en los que intervienen pigmentos de la sangre, p. ej. la hemoglobina, la bilirrubina)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/26 (en los que interviene una oxidorreductasa)

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Fragmento de la descripción:

Fructosil peptidil oxidasa y un sensor para analizar una proteína glucosilada Área técnica

La presente invención está relacionada con una nueva fructosil peptidil oxidasa (FPOX). Más concretamente, la presente invención está relacionada con una fructosil peptidil oxidasa para su utilización en un equipo y un sensor para la medida de proteínas glucosiladas, como albúmina, fructosamina, HbA1c, un fructosil hexapéptido, fructosil valina y fructosil valil histidina glucosiladas.

Antecedentes de la materia

Una proteína glucosilada se genera de forma no enzimática mediante un enlace covalente entre un grupo amino en una proteína y el extremo reductor de un azúcar, y también se refiere como compuesto Amadori. En la sangre, la glucosa se une a la valina en el extremo N-terminal de la cadena (3 de la hemoglobina para generar hemoglobina glucosilada (glucohemoglobina; HbA1c). LA proporción de la abundancia de HbA1c respecto hemoglobina (Hb) es mayor en los pacientes que sufren de diabetes mellitus comparado con un individuo normal sano y es conocido que la concentración de HbA1c en la sangre refleja los niveles de azúcar en sangre durante las semanas anteriores. Así, la concentración de HbA1c en sangre es bastante importante en los ensayos clínicos para el diagnóstico de la diabetes mellitus y en el control del azúcar en sangre de pacientes que sufren diabetes mellitus. La concentración de HbA1c en la sangre puede determinarse utilizando una enzima con especificidad por la fructosil valina.

La fructosil aminoácido oxidasa es una enzima dependiente de FAD que cataliza una reacción en la que el fructosil aminoácido se oxida para generar 2-ceto-D-glucosa y el correspondiente aminoácido. Se han aislado fructosil aminoácido oxidasas a partir de varios tipos de organismos y se ha sugerido que las proteínas glucosiladas como la albúmina glucosilada, HbA1c y fructosamina pueden analizarse utilizando estas enzimas.

La PE162688 describe un método para determinar de forma específica un cadena B glucosilada en el extremo N- terminal de la hemoglobina glucosilada utilizando una proteasa y una cetoamina oxidasa, preferiblemente derivada de una bacteria que pertenece al género Curvularia.

La PE22439 describe una amadoriasa eucariota que actúa sobre la fructosil valil histidina en presencia de oxígeno y que cataliza una reacción para generar un a-cetoaldehído, valil histidina y de peróxido de hidrógeno. Otras amadoriasas y su utilización en productos para el cuidado corporal se describen en la WO 27/128542.

La PE1291416 describe una fructosil péptido oxidasa, preferiblemente derivada de Coniochaeta sp. NISL 933 actúa sobre la fructosil valil histidina en presencia de oxígeno y cataliza una reacción para generar a-cetoaldehído, valil histidina y peróxido de hidrógeno y métodos para la cuantificación de proteína glucosilada. La JP1146769 describe una fructosil aminoácido oxidasa derivada del género Penicillium y un método para determinar la hemoglobina

glucosilada.

Las estructuras primarias de las fructosil aminoácido oxidasas fúngicas y su aplicación a la determinación de las proteínas glucosiladas se describe en Yoshida et al, Eur.J.Biochem, 242, 1996, 499-55.

La PE2354224, que representa el estado de la material de acuerdo al artículo 54(3) EPC, describe una fructosil peptidil oxidasa derivada de Phaeosphaeria nodorum y su utilización para la determinación de proteínas glucosiladas. Sin embargo, la PE2354224 no proporciona ninguna descripción sobre los mediadores electrónicos específicos que se utilizan aquí.

Para analizar la HbA1c con una elevada especificidad, la fructosil aminoácido oxidasa preferiblemente posee selectividad hacia la fructosilvalina comparado con la fructosil lisina. Más preferiblemente, la fructosil aminoácido oxidasa puede poseer una actividad oxidasa hacia la fructosil valil histidina, que se corresponde con dos residuos de la aminoácido en el extremo N-terminal de la Hb. Hirokawa et al. (Biochem Biophys Res Commun, 311(1), 23, 14-111) describen las fructosil peptidil oxidasas derivadas de las bacterias filamentosas de los géneros Achaetomiella y Chaetomius.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una nueva fructosil peptidil oxidasa para su utilización en la determinación de proteínas glucosiladas.

Descripción de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de la fructosil peptidil oxidasa derivada de Phaeosphaeria nodorum con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura. 1 (Id. de Sec. N°:1). En un aspecto, la presente invención proporciona la utilización de una fructosil peptidil oxidasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 9% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se indica en el Id. de Sec.

N°:1 y posee un valor de Km frente a la fructosil valil histidina de 1 mM o inferior para analizar una proteína glucosilada en una muestra en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metllsulfato de 1-metox¡-5-metilfenaz¡n¡o/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi- propoxl)-5-et¡l-fenanz¡nio, NA BM31 1144 clorhidrato de (N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina) o N-N-4-dimetil-nitrosoanilina. La presente invención también proporciona la utilización de una fructosil peptidil oxidasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 9% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se indica en el Id. de Sec. N°:1 y posee un valor de Vmax/Km hacia la fructosil valil histidina de 1U/mgmM o superior para determinar una proteína glucosilada en una muestra en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metoxi- 5-metllfenazlnlo/2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 clorhidrato de (N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina) o N- N-4-dlmetll-nltrosoanilina. La presente invención también proporciona la utilización de una fructosil peptidil oxidasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 9% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se indica en el Id. de Sec. N°:1 y con una actividad residual del 5% o superior cuando se trata con calor a 5°C durante 1 minutos para aanalizar una proteína glucosilado en una muestra en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio/ 2,6- dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 clorhidrato de (N,N- bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina) o N-N-4-dimetil- nitrosoanilina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar una proteína glucosilada en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con la fructosil peptidil oxidasa como se ha definido anteriormente, y determinar la cantidad de proteína glucosilada oxidada por la fructosil peptidil oxidasa en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP metilsulfato de (1-metoxi-5- metilfenazinio/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 clorhidrato de (N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina) o N- N-4-dimetil-nitrosoanilina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar la HbA1c que comprende la digestión de HbA1c en una muestra para generar fructosil valina o fructosil valil histidina, poner en contacto la fructosil valina o fructosil valil histidina... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. La utilización de fructosil peptidil oxidasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 9% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se indica en el Id. de Sec. N°:1 y que posee un valor de Km frente a la fructosil valil histidina de 1 mM o inferior para determinar una proteína glucosilada en una muestra en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metoxi-5- metilfenazinio/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 (clorhidrato de N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxi-etil-4-nitrosoanilina) o N- N-4-dimetil-nitrosoanilina.

2. La utilización de fructosil peptidil oxidasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 9% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se indica en el Id. de Sec. N°:1 y posee un valor de Vmax/Km frente a la fructosil valil histidina de 1U/mg mM o superior para determinar una proteína glucosilada en una muestra en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metoxi- 5-metilfenazinio/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 (clorhidrato de N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina) o N- N-4-dimetil-nitrosoanilina.

3. La utilización de fructosil peptidil oxidasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 9% de identidad con la secuencia de aminoácidos que se indica en el Id. de Sec. N°:1 y con una actividad residual del 5% o superior cuando se trata con calor a 5°C durante 1 minutos para determinar una proteína glucosilada en una muestra en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 (clorhidrato de N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4- nitrosoanilina) o N-N-4-dimetil-nitrosoanilina.

4. Un método para determinar una proteína glucosilada en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con la fructosil peptidil oxidasa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y determinar la cantidad de la proteína glucosilada oxidada por la fructosil peptidil oxidasa en presencia de un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metoxi-5-metilfenazinio/ 2,6- dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 (clorhidrato de N,N- bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina) o N-N-4-dimetil- nitrosoanilina.

5. Un método para determinar la HbA1c que comprende la digestión de HbA1c en una muestra para generar fructosil valina o fructosil valil histidina, poner en contacto la fructosil valina o fructosil valil histidina con la fructosil peptidil oxidasa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y determinar la cantidad de fructosil valina o fructosil valil histidina oxidada.

6. Un dispositivo para determinar la fructosil valina, fructosil valil histidina, un fructosil hexapéptido o la HbA1c en una muestra que comprende la fructosil peptidil oxidasa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y un mediador de la transferencia de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1- metoxi-5-metilfenazinio/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanz¡nio, NA BM31 1144 (clorhidrato de N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4- nitrosoanilina) o N-N-4-dimetilnitrosoanilina.

7. El dispositivo tal y como se reivindica en la reivindicación 6, en el que el mediador de la transferencia de electrones es N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina.

8. El dispositivo tal y como se reivindica en la reivindicación 6 o 7, que además comprende uno o más reactivos seleccionados de entre saponina, bilirrubina oxidasa y proteinasa N.

9. Un equipo para determinar la fructosil valina, fructosil valil histidina, un fructosil hexapéptido o HbA1c en una muestra que comprende la fructosil peptidil oxidasa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un mediador de la transferencia de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1- metoxi-5-metilfenazinio/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 (clorhidrato de N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NABM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4- nitrosoanilina) o N-N-4-dimetil-nitrosoanilina.

1. El equipo tal y como se reivindica en la reivindicación 9, en el que el mediador de la transferencia de electrones es N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina.

11. El equipo tal y como se reivindica en la reivindicación 9 o 1, que además comprende uno o más reactivos seleccionados de entre saponina, bilirrubina oxidasa y proteinasa N.

12. Un electrodo enzimático con fructosil peptidil oxidasa como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un mediador de electrones, y dicho mediador de electrones es mPMS/DCIP (metilsulfato de 1-metox¡-5- metilfenazinio/ 2,6-dicloroindofenol), cPES (trifluoroacetato-1-(3-carboxi-propoxi)-5-etil-fenanzinio, NA BM31 1144 (clorhidrato de N,N-bis-(hidroxietil)-3-metoxi-nitrosoanilina, NA BM31 18 (N,N-bis-hidroxietil-4-nitrosoanilina) o N-

N- 4-dimetil-nitrosoanilina, que están inmovilizados sobre el electrodo.

13. El electrodo enzimático tal y como se reivindica en la reivindicación 12, en el que la fructosil peptidil oxidasa se inmoviliza sobre el electrodo utilizando un fotopolímero de azida de unidad colgante soluble en agua (AWP).

14. El electrodo enzimático tal y como se reivindica en la reivindicación 12 o 13, que además comprende N,N-bis-

hidroxietil-4-nitrosoanilina inmovilizada sobre el electrodo.

15. Un sensor enzimático para determinar la fructosil valina, fructosil valil histidina, un fructosil hexapéptido o HbA1c que comprende el electrodo enzimático de cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 14 como electrodo de trabajo. 15