ELISA para VEGF.

Un método in vitro para detectar formas selectivas del factor de crecimiento endotelial

(VEGF) (VEGF110+) en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto e incubar la muestra biológica con un reactivo de captura inmovilizado en un soporte sólido, donde el reactivo de captura es el anticuerpo monoclonal 5C3 producido por el hibridoma 5C3.1.1depositado en la ATCC con el número PTA-7737;

(b) separar la muestra biológica del reactivo de captura inmovilizado:

(c) poner en contacto el complejo formado por el reactivo de captura inmovilizado y la molécula diana con un anticuerpo detectable que se une a los dominios de unión a los receptores KDR y/o FLT1 de VEGF o que se une a un epítopo en VEGF 1-110;y

(d) medir el nivel de VEGF110+ unido al reactivo de captura usando un medio de detección para el anticuerpo detectable.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/080310.

Solicitante: GENENTECH, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1 DNA WAY SOUTH SAN FRANCISCO, CA 94080-4990 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MENG, YU-JU, G., HONG,KYU H, GUTIERREZ,JOHNNY.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))

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Fragmento de la descripción:

ELISA para VEGF

Campo de la invenciïn Esta invenciïn se relaciona con inmunoensayos para detectar determinadas poblaciones de VEGF que pueden usarse como mïtodos de diagnïstico y pronïstico para pacientes con cïncer, patologïas cardiovasculares u otras patologïas.

Antecedentes Actualmente, estï bien establecido que la angiogïnesis estï implicada en la patogïnesis de diversos trastornos. Estos incluyen tumores sïlidos, sïndromes neovasculares intraoculares, tales como retinopatïas proliferativas o degeneraciïn macular asociada con la edad (DMAD) , artritis reumatoide, y psoriasis (rheumatoid arthritis, and psoriasis (Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992) ; Klags-brun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991) ; y Garner A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2ï ediciïn (Marcel Dekker, NY, 1994) , pïgs. 1625-1710) . En el caso de tumores sïlidos, la neovascularizaciïn permite que las cïlulas tumorales adquieran una ventaja en el crecimiento y autonomïa proliferativa en comparaciïn con las cïlulas normales. Por consiguiente, se ha observado una correlaciïn entre la densidad de los microcapilares en secciones de tumores y la supervivencia del paciente en cïncer de mama asï como en algunos otros tumores (Weidner et al. N Engl J Med 324:1-6 (1991) ; Horak et al. Lancet 340:1120-1124 (1992) ; y Macchiarini et al. Lancet 340:145-146 (1992) ) .

La bïsqueda de reguladores positivos de la angiogïnesis ha ofrecido muchos candidatos, incluyendo, por ejemplo, aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-!, HGF, TNF-α, angiogenina, IL-8, etc. (Folkman et al., citado anteriormente, y Klagsbrun et al., citado anteriormente) . Algunos de los reguladores negativos identificados hasta ahora, incluyen trombospondina (Good et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628 (1990) ) , el fragmento N-terminal de 16 kilodalton de prolactina (Clapp et al. Endocrinology, 133:1292-1299 (1993) ) , angiostatina (O’Reilly et al. Cell 79:315-328 (1994) ) , y endostatina (O’Reilly et al. Cell 88:277-285 (1996) ) .

El trabajo realizado durante algunos de los ïltimos aïos ha establecido el papel fundamental del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la regulaciïn de la angiogïnesis normal y la anormal (Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997) ) .El hallazgo de que incluso la pïrdida de un alelo individual de VEGF produce mortalidad embrionaria apunta a un irremplazable papel desempeïado por este factor en el desarrollo y la diferenciaciïn del sistema vascular (Ferrara et al., citado anteriormente) .

Ademïs, se ha demostrado que el VEFG es un mediador clave de la neovascularizaciïn asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara et al., citado anteriormente) . El ARNm de VEGF se sobreexpresa en la mayorïa de los tumores humanos examinados (Berkman et al. J Clin Invest 91:153-159 (1993) ; Brown et al. Human Pathol, . 26:86-91 (1995) ; Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993) ; Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996) ; y Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995) ) . Tambiïn, la concentraciïn de VEGF en los fluidos oculares tiene una correlaciïn alta con la presencia de proliferaciïn activa de vasos sanguïneos en pacientes con retinopatïas diabïticas y otras retinopatïas relacionadas con isquemia (Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994) ) . Ademïs, los estudios han demostrado la localizaciïn de VEGF en las membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por degeneraciïn macular aguda (DMA) (Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996) ) .

El VEGF lo producen los tejidos y no tiene necesidad de entrar a la circulaciïn para ejercer su efecto biolïgico, sino que actïa mïs bien localmente como un regulador paracrino. Un estudio reciente de Yang et al. J. Pharm. Exp. Ther.

284:103 (1998) encontrï que la eliminaciïn de rhVEGF165 de la circulaciïn es muy rïpida, lo que sugiere que el VEGF endïgeno en la circulaciïn es probablemente el resultado de la sïntesis continua de VEGF. Ademïs, varios estudios han tratado de correlacionar los niveles de VEGF circulante con la carga tumoral y han sugerido los niveles de VEGF como un marcador pronïstico potencial (Ferrari and Scagliotti Eur. J. Cancer 32A:2368 (1996) ; Gasparini et al. J. Natl. Cancer Inst. 89:139 (1997) ; Kohn Cancer 80:2219 (1997) ; Baccala et al. Urology 51:327 (1998) ; Fujisaki et al. Am. J. Gastroenterol. 93:249 (1998) ) . Claramente, la capacidad de medir adecuadamente VEGF serï importante para entender su papel (o papeles) potencial en numerosos procesos biolïgicos, tales como el mantenimiento de la permeabilidad vascular, el ciclo menstrual, la isquemia, la diabetes, el cïncer, los trastornos intraoculares, etc.

En la bibliografïa se informa ampliamente de concentraciones variables de VEGF endïgeno en pacientes normales y enfermos, que oscilan entre niveles indetectables y niveles altos. La capacidad de medir los niveles de VEGF endïgeno depende de la disponibilidad de ensayos sensibles y especïficos. Se ha informado de ensayos colorimïtricos, de quimioluminiscencia y fluorimïtricos basados en ensayos de inmunoabsorciïn ligados a enzimas (ELISA) para VEGF. Houck et al., citado anteriormente, (1992) ; Yeo et al. Clin. Chem. 38:71 (1992) ; Kondo et al. Biochim. Biophys. Acta 1221:211 (1994) ; Baker et al. Obstet. Gynecol. 86:815 (1995) ; Hanatani et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1958 (1995) ; Leith y Michelson Cell Prolif. 28:415 (1995) ; Shifren et al. J. Clin. Endocrinol.

Metab. 81:3112 (1996) ; Takano et al. Cancer Res. 56:2185 (1996) ; Toi et al. Cancer 77:1101 (1996) ; Brekken et al. Cancer Res. 58:1952 (1998) ; Obermair et al. Br. J. Cancer 77:1870-1874 (1998) ; Webb et al. Clin. Sci. 94:395-404 (1998) .

Por ejemplo, Houck et al., citado anteriormente (1992) describen un ELISA colorimïtrico que parece tener una sensibilidad de ng/ml, que podrïa no ser suficientemente sensible para detectar los niveles de VEGF endïgeno. Yeo et al., citado anteriormente (1992) describen un ensayo inmunofluorimïtrico resuelto en tiempo de dos sitios, sin embargo, no se detectï VEGF en suero normal (Yeo et al. Cancer Res. 53:2912 (1993) )

Baker et al., citado anteriormente (1995) , usando una versiïn modificada de este ensayo inmunofluorimïtrico, informaron de niveles detectables de VEGF en el plasma de gestantes, observando mayores niveles en mujeres con preeclampsia. Anthony et al. Ann. Clin. Biochem. 34:276 (1997) informaron de datos similares en gestantes utilizando un radioinmunoensayo. Hanatani et al., citado anteriormente (1995) desarrollaron un ELISA quimioluminiscente capaz de medir VEGF circulante e informaron de niveles de VEGF en sueros de 30 individuos normales (hombres y mujeres) de 8-36 pg/ml. Brekken et al, citado anteriormente (1998) describieron ensayos ELISA usando anticuerpos que tenïan preferencia de uniïn tanto solo con VEGF como con el complejo VEGF:Flk-1.

Estï disponible en el mercado un kit de ELISA de R&D Systems (Minneapolis, MN) para la detecciïn de VEGF. El kit de ELISA VEGF de R&D se ha utilizado en ensayos de tipo “sïndwich” en donde se utiliza un anticuerpo monoclonal para capturar el antïgeno diana en VEGF y se usa un anticuerpo policlonal para detectar el VEGF. Webb et al. citado anteriormente (1998) . Vïase tambiïn, por ejemplo, Obermair et al., citado anteriormente (1998) .

Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996) ; Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:5638 (1996) ; y Shifren et al., citado anteriormente (1996) tambiïn desarrollaron un ELISA colorimïtrico basado en un par de anticuerpos monoclonales duales. A pesar de que este ELISA era capaz de detectar niveles elevados de VEGF en pacientes con cïncer, carecïa... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un mïtodo in vitro para detectar formas selectivas del factor de crecimiento endotelial (VEGF) (VEGF110+) en una muestra biolïgica, que comprende las etapas de: 5

(a) poner en contacto e incubar la muestra biolïgica con un reactivo de captura inmovilizado en un soporte sïlido, donde el reactivo de captura es el anticuerpo monoclonal 5C3 producido por el hibridoma 5C3.1.1depositado en la ATCC con el nïmero PTA-7737;

(b) separar la muestra biolïgica del reactivo de captura inmovilizado:

(c) poner en contacto el complejo formado por el reactivo de captura inmovilizado y la molïcula diana con un anticuerpo detectable que se une a los dominios de uniïn a los receptores KDR y/o FLT1 de VEGF o que se une a un epïtopo en VEGF 1-110;y

(d) medir el nivel de VEGF110+ unido al reactivo de captura usando un medio de detecciïn para el anticuerpo detectable. 15

2. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que la muestra biolïgica se ha aislado de un sujeto humano.

3. El mïtodo de la reivindicaciïn 2, en el que el sujeto humano es un paciente con una enfermedad vascular,

diabïtico o con cïncer y la etapa de mediciïn (d) ademïs comprende una comparaciïn con una curva patrïn para 20 determinar el nivel de VEGF en comparaciïn con un individuo normal.

4. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que la muestra biolïgica son lisados tumorales, plasma, suero u orina.

5. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que una placa de microtitulaciïn se recubre con el reactivo de captura 25 inmovilizado.

6. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que el anticuerpo detectable es directamente detectable.

7. El mïtodo de la reivindicaciïn 6, en el que el anticuerpo detectable se amplifica mediante un reactivo fluorimïtrico. 30

8. El mïtodo de la reivindicaciïn 7, en el que el anticuerpo detectable estï biotinilado y el medio de detecciïn es avidina o estreptavidina-peroxidasa y 3, 3’, 5, 5’ –tetrametil benzidina.

9. El mïtodo de la reivindicaciïn 1, en el que el anticuerpo detectable es MAb A4.6.1. 35

10. Un kit de inmunoensayo para detectar VEGF110+ en una muestra biolïgica, comprendiendo el kit:

(a) como reactivo de captura, el anticuerpo monoclonal 5C3 producido por el hibridoma 5C3.1.1 depositado en la ATCC con el nïmero PTA-7737; y

(b) como reactivo de detecciïn, un anticuerpo detectable que se une a los dominios de uniïn a los receptores KDR y/o FLT1 de VEGF o que se une a un epïtopo en el VEGF1-110.

11. El kit de la reivindicaciïn 10, que ademïs comprende un soporte sïlido para el reactivo de captura. 45 12. El kit de la reivindicaciïn 11, en el que el reactivo de captura se inmoviliza en el soporte sïlido.

13. El kit de la reivindicaciïn 12, en el que el reactivo de captura recubre una placa de microtitulaciïn.

14. El kit de la reivindicaciïn 13, que ademïs comprende un medio de detecciïn para el anticuerpo detectable. 50

15. El kit de la reivindicaciïn 14, en el que el medio de detecciïn es colorimïtrico.

16. El kit de la reivindicaciïn 10, que ademïs comprende VEGF purificado como antïgeno patrïn. 55 17. El kit de la reivindicaciïn 10, en el que el anticuerpo detectable es MAb A4.6.1.

18. Un anticuerpo 5C3 que puede obtenerse del (o producirlo) el hibridoma 5C3.1.1 con el nïmero de depïsito PTA-7737.

19. El anticuerpo de la reivindicaciïn 18 conjugado con un marcador detectable.

20. Un hibridoma 5C3.1.1 depositado en la ATCC con el nïmero de depïsito PTA-7737.