Procedimiento de cromatografía de interacción hidrófoba.

Un procedimiento para purificar un polipéptido que comprende un marcaje de histidina que comprende las siguientes etapas:

- aplicar una solución que comprende el polipéptido con un marcaje de histidina a un material de cromatografía de interacción hidrófoba

, y

- recuperar el polipéptido que comprende un marcaje de histidina con una solución que comprende imidazol o un derivado de imidazol del material de interacción hidrófoba y purificar así el polipéptido que comprende un marcaje de histidina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2011/057960.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: GRENZACHERSTRASSE, 124 4070 BASEL SUIZA.

Inventor/es: FALKENSTEIN,Roberto, SMIDA,Maria, FUEHRLER,NICOLE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/435 (de animales; de humanos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por separación... > G01N30/02 (Cromatografía sobre columna)

PDF original: ES-2534562_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Procedimiento de cromatografía de interacción hidrófoba

Se reseña en la presente memoria un procedimiento de cromatografía de interacción hidrófoba para la purificación de polipéptidos que comprenden un mareaje de histidina mediante la elución del polipéptido del material cromatográfico con una solución que comprende imidazol o un derivado de imidazol.

Antecedentes de la invención

Las proteínas desempeñan un papel importante en la cartera médica actual. Los sistemas de expresión para la producción de polipéptidos recombinantes son bien conocidos en el estado de la técnica. Los polipéptidos para uso en aplicaciones industriales se producen principalmente en células procarióticas tales como E. coli y células de mamífero tales como células CHO, células NS, células Sp2/, células COS, células HEK, células BHK, células PER.C6® y similares.

Para aplicación humana, toda sustancia farmacéutica tiene que satisfacer distintos criterios. Para asegurar la seguridad de los agentes blofarmacéutlcos en seres humanos, tienen que retirarse por ejemplo los ácidos nucleicos, virus y proteínas de célula hospedadora, que causarían un grave daño. Para satisfacer los requisitos regulatorlos, tienen que seguir al proceso de fabricación una o más etapas de purificación. Entre otros, pureza, producción y rendimiento y desempeñan un papel Importante en la determinación del proceso de purificación apropiado.

Están bien establecidos diferentes procedimientos y se usan ampliamente para la purificación de proteínas, tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (p.ej. cromatografía de afinidad por proteína A o proteína G), cromatografía de intercambio Iónico (p.ej. Intercambio catlónlco (resinas de sulfopropilo o carboximetilo), intercambio aniónico (resinas de amlnoetllo) e Intercambio Iónico en modo mixto), adsorción tiófila (p.ej. con (5- mercaptoetanol y otros ligandos de SH), cromatografía de Interacción hidrófoba o adsorción aromática (p.ej. con fenil-Sepharose, resinas azarenofílicas o acido m-amlnofenllborónlco), cromatografía de afinidad por quelato metálico (p.ej. con material de afinidad por Ni(ll) y Cu(ll)), cromatografía de exclusión por tamaño y procedimientos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar), (véase, p.ej. Vijayalakshmi, M.A., AppI. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-12).

Mateo, C., et al. reseñan la cromatografía de afinidad por enzimas marcadas con polihistidina (J. Chrom. 915 (21) 97-16). En el documento WO 2/371, se reseñan aplicaciones novedosas de resina de níquel-ácido nitrilotriacético (NI-NTA). Se reseñan procedimientos y kits para purificar proteínas marcadas con his en el documento WO 25/3592. En el documento WO 98/6739, se reseña un procedimiento para la purificación de proteínas recombinantes.

Se reseñan procedimientos de purificación por afinidad que implican miméticos de aminoácidos como agentes de elución en el documento WO 94/7912. En el documento US 24/15276, la separación de ácido nucleico usando cromatografía de afinidad por metal inmovilizado. Se reseña un proceso para la purificación de factor VIII en el documento US 6.5.82. En el documento US 27/37966, se reseña una purificación por cromatografía de interacción hidrófoba de polipéptidos del factor Vil.

Sumario de la invención

Se ha encontrado que puede recuperarse un polipéptido que comprende un mareaje de histidina de un material de cromatografía de interacción hidrófoba con una solución que comprende imidazol o un derivado de imidazol. Con el procedimiento reseñado en la presente memoria, pueden evitarse soluciones de recuperación que comprenden disolventes orgánicos, tales como 2-propanol, sin pérdida de selectividad y rendimiento.

Por tanto, se reseña en la presente memoria un procedimiento para obtener o purificar un polipéptido que comprende un mareaje de histidina que comprende las siguientes etapas:

aplicar una primera solución que comprende el polipéptido con un mareaje de histidina a un material de cromatografía de interacción hidrófoba, y

recuperar el polipéptido que comprende un mareaje de histidina del material de cromatografía de interacción hidrófoba aplicando una segunda solución que comprende imidazol o un derivado de imidazol, y obteniendo o purificando así el polipéptido que comprende un mareaje de histidina.

Se reseña también en la presente memoria un procedimiento para producir un polipéptido que comprende un mareaje de histidina que comprende las siguientes etapas:

cultivar una célula procariótica o eucariótica que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un mareaje de histidina,

recuperar el polipéptido que comprende un mareaje de histidina de las células y/o el medio de cultivo, opcionalmente en forma de cuerpos de inclusión,

solubilizar y/o replegar opcionalmente el polipéptido que comprende un mareaje de histidina, purificar el polipéptido solubilizado y/o replegado que comprende un mareaje de histidina con un procedimiento de cromatografía de interacción hidrófoba, produciendo así un polipéptido que comprende un mareaje de histidina.

En una realización, el material de cromatografía de interacción hidrófoba comprende una matriz de agarosa a la que se han ligado ligandos hidrófobos. En otra realización, el ligando se selecciona de n-, iso- o neo-alquilenglicoles alifáticos u oligoalquilenglicoles. En una realización adicional, el ligando se selecciona de grupos propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, polietilenglicol, y polipropilenglicol. En una realización adicional, el ligando es un ligando de fenilo y la segunda solución en la etapa de recuperación comprende, además del imidazol o derivado de imidazol, 2-propanol.

Descripción detallada de la invención

Se reseña en la presente memoria un procedimiento de cromatografía de interacción hidrófoba escalable ejecutado en modo de unión y elución para la purificación de polipéptidos que comprenden un mareaje de histidina, en el que la recuperación del polipéptido del material de cromatografía de interacción hidrófoba es con una solución que comprende imidazol o un derivado de imidazol tal como histidina. Usando este sistema de elución, puede evitarse la puesta en práctica de tampones de elución que contienen disolventes orgánicos como 2-propanol, sin pérdida de selectividad y rendimiento.

Los términos "aplicar a" y equivalentes gramaticales del mismo designan una etapa parcial de un procedimiento de purificación en que se pone en contacto una solución que contiene una sustancia de interés para purificar con una fase estacionaria. Esto designa que a) la solución se añade a un dispositivo cromatográfico donde está localizada la fase estacionaria, o b) la fase estacionaria se añade a la solución que comprende la sustancia de interés. En el caso a), la solución que contiene la sustancia de interés para purificar pasa a través de la fase estacionaria, permitiendo una interacción entre la fase estacionaria y las sustancias en solución. Dependiendo de las condiciones, tales como por ejemplo pH, conductividad, concentración salina, temperatura y/o caudal, se unen algunas sustancias de la solución a la fase estacionaria, y por tanto se retiran de la solución. Permanecen en solución otras sustancias. Las sustancias que permanecen en solución pueden encontrarse en la circulación. La "circulación" designa la solución obtenida después del paso por el dispositivo cromatográfico independientemente de su origen. Puede ser la solución aplicada que contiene la sustancia de interés o el tampón que se usa para lavar la columna o que se usa para producir la elución de una o más sustancias... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para purificar un polipéptido que comprende un mareaje de histidina que comprende las siguientes etapas:

aplicar una solución que comprende el polipéptido con un mareaje de histidina a un material de cromatografía de interacción hidrófoba, y

recuperar el polipéptido que comprende un mareaje de histidina con una solución que comprende ¡midazol o un derivado de imidazol del material de interacción hidrófoba y purificar así el polipéptido que comprende un mareaje de histidina.

2. Un procedimiento para producir un polipéptido que comprende un mareaje de histidina que comprende las siguientes etapas:

cultivar una célula procariótica o eucariótica que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un mareaje de histidina,

recuperar el polipéptido que comprende un mareaje de histidina de las células y/o el medio de cultivo, purificar el polipéptido que comprende un mareaje de histidina con un procedimiento de cromatografía de interacción hidrófoba que comprende las siguientes etapas:

aplicar una solución que comprende el polipéptido con un mareaje de histidina a un material de cromatografía de interacción hidrófoba, y

recuperar el polipéptido que comprende un mareaje de histidina con una solución que comprende imidazol o un derivado de imidazol del material de cromatografía de interacción hidrófoba y producir así un polipéptido que comprende un mareaje de histidina.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el material de cromatografía de interacción hidrófoba comprende una matriz de agarosa a la que se ha ligado un ligando hidrófobo.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el ligando es un ligando de propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, polietilengllcol o polipropilenglicol.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el ligando es un ligando de fenilo y la solución en la etapa de recuperación comprende además 2-propanol.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende las siguientes etapas:

aplicar una primera solución al material de cromatografía de interacción hidrófoba,

aplicar una segunda solución que comprende un polipéptido que comprende un mareaje de histidina a un material de cromatografía de interacción hidrófoba, y

recuperar y producir o purificar así el polipéptido que comprende un mareaje de histidina con una cuarta solución que comprende imidazol o un derivado de imidazol,

comprendiendo la primera solución una primera sustancia tampón, comprendiendo la segunda solución una segunda sustancia tampón y comprendiendo la cuarta solución una cuarta sustancia tampón, en el que la cuarta sustancia tampón es imidazol o un derivado de imidazol, y en el que la segunda sustancia tampón y la cuarta sustancia tampón son sustancias tampón diferentes.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque comprende, después de aplicar la segunda solución y antes de recuperar, la siguiente etapa:

aplicar una tercera solución al material de cromatografía de interacción hidrófoba,

comprendiendo la tercera solución una tercera sustancia tampón, siendo la segunda sustancia tampón y la tercera sustancia tampón y la cuarta sustancia tampón todas sustancias tampón diferentes.