Compuestos antiproliferativos, conjugados de los mismos, procedimientos para éstos y usos de los mismos.

Un compuesto que tiene una estructura representada por la fórmula (II)**Fórmula**

en la que

n es 0, 1 o 2;

R1, R2 y R3 son independientemente H, alquilo C1-C10 sin sustituir o sustituido, alquenilo C2-C10 sin sustituir o sustituido, alquinilo C2-C10 sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o sustituido,

(CH2)1-2O(alquilo C1-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2O(alquenilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2O(alquenilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2OC(≥O)(alquilo C1-C10), (CH2)1-2OC(≥O)(alquenilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, (CH2)1-2OC(≥O)(alquinilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, C(≥O)(alquilo C1-C10) sin sustituir o sustituido, C(≥O)(alquenilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, C(≥O)(alquinilo C2-C10) sin sustituir o sustituido, cicloalifático sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido, arilalquilo sin sustituir o sustituido o alquilarilo sin sustituir o sustituido;

R4 es;**Fórmula**

y

R5 es H, alquilo C1-C5, alquenilo C2-C5, alquinilo C2-C5, CO(alquilo C1-C5), CO(alquenilo C2-C5) o CO(alquinilo C2-C5);

o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo, una amida farmacéuticamente aceptable del mismo en el grupo carboxilo de R4 con el grupo α-amino de un α-aminoácido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/044078.

Solicitante: E. R. Squibb & Sons, L.L.C.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: Route 206 and Province Line Road Princeton, NJ 08540 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: GANGWAR, SANJEEV, ZHANG,Qian, CHENG,HENG, CONG,QIANG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con hasta cuatro aminoácidos en una secuencia... > C07K5/06 (Dipéptidos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por los... > A61K47/48 (estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con hasta cuatro aminoácidos en una secuencia... > C07K5/02 (que contienen al menos un enlace peptídico anormal)

PDF original: ES-2525351_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Compuestos antiproliferativos, conjugados de los mismos, procedimientos para éstos y usos de los mismos Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a compuestos estructuralmente relacionados con las tubulisinas, conjugados de los mismos con un ligando, procedimientos para fabricar y usar tales compuestos y conjugados y composiciones que comprenden tales compuestos y conjugados.

Las tubulisinas son citotoxinas originalmente aisladas de cultivos de las mixobacterias Archangium gephyra o Angiococcus disciformis, con cada organismo produciendo una mezcla de tubulisinas diferente. (Sasse y col. 2000; Reichenbach y col. 1998) . Su estructura cristalina y su ruta biosintética se han elucidado (Steinmetz y col. 2004) y sus genes de biosintesis se han secuenciado (Hoefle y col. 2006b) . La propia pretubulisina, un precursor biosintético de las tubulisinas, también ha mostrado poseer actividad significativa (Ullrich y col. 2009) . (Las citas integras de los documentos citados en el presente documento por el primer autor o inventor y el año se enumeran al final de la presente memoria descriptiva) .

Las tubulisinas pertenecen a un grupo de polipéptidos y depsipéptidos antimitóticos naturales que incluyen las fomopsinas , las dolastatinas y las criptoficinas (Hamel 2002) . También existen agentes antimitóticos distintos de polipéptidos o depsipéptidos, por ejemplo paclitaxel, las maitansinas y las epotilonas. Durante la mitosis, los microtubulos de la célula se reorganizan para formar el uso mitótico, un procedimiento que requiere el rápido ensamblaje y desesamblaje de las proteínas constituyentes del microtúbulo a-y [3-tubulina. Los agentes antimitóticos bloquean el presente proceso y evitan que una célula sufra mitosis, aunque al nivel molecular el mecanismo de bloqueo exacto puede diferir de un agente a otro. Las tubulisinas evitan el ensamblaje de las tubulinas en microtúbulos, causando que las células afectadas se acumulen en la fase G2fM y sufran apoptosis (Khalil y col. 2006) . En cambio, el paclitaxel efectúa el mismo resultado final por unión a microtúbulos y evitar su desensamblaje.

Las tubulisinas tienen un armazón de tetrapeptidilo construido a partir de una subunidad aminoacídica proteinogénica y tres subunidades aminoacídicas no proteinogénicas: ácido N-metilpipecolínico (Mep) , isoleucina (lIe) ;. tubuvalina (Tuv) y bien tubufenilalanina (Tup, RA equivale a H en la fórmula (1) más adelante) o tubulirosina (Tut, R equivale a OH) . Se conocen aproximadamente una docena de tubulisinas que se dan en la naturaleza (llamadas A, B, etc.) , estando los sitios de variación estructural entre ellas en residuos RA, RO Y Re como se muestran en la Fórmula (1) y en la Tabla 1:

Mep 11. Tuv TupfTut

'7

Tabla 1 -Tubul isinas ue Se Dan en la Naturaleza Tubulisina I R I R I R

A OH OC ( O) Me CH20C ( O) i-Bu B OH OC (=O) Me CH20C (=O) n-Pr

C OH OC (=O) Me CH20C (=O) Et

D H OC (=O) Me CH20C (=O) i-Bu E H OC (=O) Me CH20C (=O) n-Pr

F H OC (=O) Me CH20C (=O) Et

G OH OC (=O) Me CH20C{=O) CH=CH2

H H OC (=O) Me CH20C (=O) Me I OH OC (=O) Me CH20C (=O) Me U H OC (=O) Me H

V H OH H

Z OH OH H Pretubulisina H H Me Kaur y col. 2006 estudiaron las propiedades antiproliferativas de la tubulisina A y encontraron que era más potente que otros agentes antimitóticos tales como paclitaxel y vinblastina y era activa en ensayos de xenoinjertos contra diversas 40 lineas celulares cancerosas. Adicionalmente, la tubulisina A indujo apoptosis en células cancerosas pero no en células

normales y mostró propiedades antiangiogénicas significativas potenciales en ensayos in vitro. Las propiedades antimitóticas de otras tubulisinas se han evaluado también y generalmente se ha encontrado que se comparan favorablemente contra aquellas de agentes antimitóticos no tubulisinas (véanse, por ejemplo, Balasubramanian y col. 2009; Steinmetz y col. 2004; Wipf Y col. 2004) . Por las presentes razones, hay considerable interés en las tubulisinas como agentes anticancerigenos (véase, por ejemplo, Domling y col. 2005c; Hamel 2002) .

Numerosas publicaciones describen esfuerzos dirigidos a la sintesis de tubulisinas, incluyendo: Balasubramanian y col. 2009; Domling y col. 2006; Hoefle y col. 2003; Neri y col. 2006; Peltier y col. 2006; Sani y col. 2007; Sasse y col. 2007; Shankar y col. 2009; Shibue y col. 2009; y Wipf y col. 2004. Otras publicaciones describen estudios de relación estructura-actividad (SAR) , por medio de la preparación y evaluación de análogos o derivados de tubulisina: Balasubramanian y col. 2008 y 2009; Domling 2006; Domling y col. 2005a; Ellman y col. 2009; Hoefle y col. 2001 & 2006a; Pallerson y col. 2007 & 2008; Richter 2008; Vlahov y col. 2009; Wang y col. 2007; yWipf y col. 2007 ~ 2010. Los estudios de SAR exploraron principalmente variaciones estructurales en el anillo de Mep, en los residuos R y Re de la subunidad Tuv, yen el anillo aromático o en la cadena de carbonos alifática de la subunidad TupfTut.

Domling y col. 2005 revela conjugados de tubulisinas con una molécula compañera descrita genéricamente como un polimeroo una biomolécula, pero con ejemplos reales limitados a polietilenoglicol (PEG) como la molécula compañera. Otros documentos que describen los conjugados de tubulisinas son Boyd y col. 2008 y 2010; Vlahov y col. 2008a, 2008b y 2010; Leamon y col. 2008 Y2009; Reddy y col. 2009; y Low y col. 2009. Leung y col. 2002 revela polipéptidos polianiónicos que pueden conjugarse a fármacos (incluyendo tubulisinas) para incrementar su bioactividad y solubilidad en agua.

Davis y col. 2008 y Schluep y col. 2009 revela formulaciones basadas en ciclodextrina en las que las tubulisinas están covalentemente unidas a una ciclodextrina por medio de un resto de engarce hidracida-disulfuro unido al grupo carboxi lo TupfTut.

Breve sumario de la invención La presente invención revela compuestos antiproliferativos novedosos que están relacionados estructuralmente relacionados con las tubulisinas, son citotóxicos o citostáticos contra muchas células cancerosas y se cree que actúan por un mecanismo antimitótico. Los presentes compuestos se pueden conjugar con ligandos tales como anticuerpos para administración dirigida contra células cancerosas.

En una realización, la presente invención proporciona un compuesto que tiene una estructura representada por fórmula (11)

en la que nesO 102; Rl, R2 Y R3 son independientemente H, alquilo G, -Glo sin sustituir o sustituido, alquenilo Cz-Glo sin sustituir o sustituido, alquinilo Cr Clo sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o sustituido, (CH2h.20 (alquilo Gl-ClO) sin sustituir o sustituido, (GH2) 1_Z0 (alquenil0 Gr GlO) sin sustituir o sustituido, (CH2h_zO (alquinilo G2-GlO) sin sustituir o sustituido, (GH2) '_ZOC (=O) (alquilo G, -ClO) sin sustituir o sustituido, (CH2) , _ZOC (=O) (alquenilo G2-ClO) sin sustituir o sustituido, (GHZ) '.20G (=O) (alquinilo CZ-ClO) sin sustituir o sustituido, C (=O) (alquilo Cl-GlO) sin sustituir o sustituido, C (=O) (alquen ilo G2-ClO) sin sustituir o sustituido, C (=O) (alquinilo C2-Gl0) sin sustituir o sustituido, cicloalifático sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido. arilalquilo sin sustituir o sustituido, o alquila rilo sin sustituir o sustituido;

R4

es NH2 NH2

~I

~

\ \

NH

Ú , (CH') '~3CH3 ; y

\:J~~~

CO, H 0CO, H

R~ es H, alquilo C, -C~, alquenilo C2-C5, alquinilo C2-C~, CO (alquilo C, -C5) , CO (alquenilo C2""C~) , o CO (alquinilo C2-C5) ;

o un éster farmacéutica mente aceptable del mismo, una amida farmacéuticamente aceptable... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un compuesto que tiene una estructura representada por la fórmula (11)

(11)

en la que nesO 102;

R\ R2 Y R3 son independientemente H, alquilo C, -C, o sin sustituir o sustituido, alquenilo C2-C, O sin sustituir o sustituido, alquinilo Cz-C, o sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o sustituido, (CH2h.20 (alquilo Cl-ClO) sin sustituir o sustituido, (CH2) 1_20{alquenilo C2-C, O) sin sustituir o sustituido, (CH2h_zO{alquenilo C2-ClO) sin sustituir o sustituido, (CHz) '.20C{=O) {alquilo C, -C, o) . (CH2h_zOC (=O) (alquenilo C2-C, O) sin sustituir º sustituido, (CH2) 1_20C (=O) {alquinilo C2-ClO) sin sustituir o sustituido, C (=O) (alquilo C, -Cl0) sin sustituir o sustituido, C (=O) (alquenilo C2-ClO) sin sustituir o sustituido, C{=O) {alquinilo CZ-ClO) sin sustituir o sustituido, cicloalifátioo sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido, arilalquilo sin sustituir o sustituido o alquilarilo sin sustituir o sustituido;

R4

es NH, NH,

NH'

", 1

\: \: \:

~

CO, H 20

NH

Ú , (CH2) 1 _3CH3 ; y

J~~I

\: CO, H 0CO, H

R5

es H, alquilo Cl -CS, alquenilo C2-CS, alquinilo Cz-Cs. CO (alquilo C, -Cs) , CO (alquenilo Cz-Cs) o CO (alquinilo C2-C5) ;

o un éster farmacéutica mente aceptable del mismo, una amida farmacéuticamente aceptable del mismo en el grupo carboxi lo de R4 con el grupo a-amino de un a-aminoácido o una sal farmacéutica mente aceptable del mismo.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-a) 30

(U-a)

en la que R4a es NH

Ú , , o (CH2lt-3C H3

\:J~~

CO, H 0 CO, H 35

3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-a') :

(JI-a')

en la que R2

es H, alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS, CH20 (alquilo Cl-CS) , CH20 (alquenilo C2-CS) , CH¡O (C=O) (alquilo Cl-CS) o CH20C{=O) {alquenilo C2-CS) : y

R3 es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cl -CS, C{=O) alquilo Cl -Cs o C{=O) alquenilo Cl -CS.

4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-b) : NH,

(II-b)

Co, H

5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-b') : NH,

(I1-b')

CO, H

enlaque R2

es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cl -CS, CHlO{alquilo Cl-CS) , CH20 (alquenilo C2-CS) , CHlO (C=O) (alquilo Cl-Cs) o CH20C (=O) (alquenilo C2-CS) ; y

R3 es H, alquilo Cl-CS, alquenilo Cr Cs, C{=O) alquilo Cl-CS o C{=O) alquenilo C2-CS.

6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tienen una estructura de acuerdo con las fórmulas (IU-a) , III-b) , (III-c) , (III-d) , (III-e) , (III-f) , (III-g) , (III-h) , (III-i) , (III-j) , (III-k) , (111-1) , (l1I-m) , (l1I-n) , (III-o) , (III-p) , (III-q) , (III-r) , (III-s) , (l1I-t) , (l1I-u) , (III-v) , (IIJ-w) o (III-y) .

7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una estructura representada por la fórmula (II-c) NH,

(II-e)

l3 l4 IS

en la que Res Me, n-Pr, CH20Me o CHzOC (=O) CHzCH (Me) 2; Res Me o C (=O) Me; y Res H o alquilo Cl-C~.

8. Una molécula enlazadora de compuesto que tiene una estructura representada por la fórmula (V-b)

ft¡ln O Y c:¡, R3 O ~~

(V-b)

't;l:"'y~".~~~N, AN'R"'- (X"JaC (XZ) b-Ny-L

J

R' O R' R' 5 H O

en la que n es O, 1 02: R', R2 YR3 son independientemente H, alquilo C, -ClO sin sustituir o sustituido, alquenilo Cr C, o sin sustituir o sustituido, alquinilo C2-C, O sin sustituir o sustituido, arilo sin sustituir o sustituido, heteroarilo sin sustituir o sustituido, (CH2h·20 (alquilo C, -C, o) sin sustituir o sustituido, (CH2) '_20 (alquenilo Cr ClO) sin sustituir o sustituido, (CH2) , _20 {alquinilo Cr Clo) sin sustituir o sustituido, (CH2h.20C{=O) {alquilo Cl-C, O) , (CH2h_20C{=O) {alquenilo C2-C, O) sin sustituir o sustituido, (CH2) '_20C (=O) (alquinilo C2-C, O) sin sustituir o sustituido, C{=O) {alquilo C, -Clo) sin sustituir o sustituido, C{=O) {alquenilo C2-ClO) sin sustituir o sustituido, C{=O) {alquinilo Cr ClO) sin sustituir o sustituido, cicloalifático sin sustituir o sustituido, heterocicloalifático sin sustituir o sustituido, arilalquilo sin sustituir o sustituido o alquilarilo sin sustituir o sustituido: R4, es H H

NH,

N-¡ N-¡

\

C02R'2 CO-!

NH,

~-¡ NH'

c7'1 ", 1

\ ~.

'"

\

\ ~

CO-! Co, R" CO-!

NH

Ú , , O

J~~I,

\ CO, -¡

(CH2) 1_3CH3

0co, -¡

en las que R, 2 es H, alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS o alquinilo C2-CS: y RS es H, alquilo Cl-CS, alquenilo C2-CS, alquinilo C2-CS, CO (alquilo C, -Cs) , CO (alquinilo C2-CS) o CO (alquinilo C2-eS) ;;

XO y XZ son grupos espaciadores; 25 C es un grupo escindible; y a y b son independientemente Oo 1;

en donde el grupo R~' está unido mediante un grupo carboxilo o un grupo amina de los mismo al grupo x D en el caso de que a sea 1 o al grupo e en el caso de que a sea O.

9. La molécula enlazadora de compuesto de acuerdo con la reivindicación 8 que tiene una estructura representada por 5 la fónnula (V-e) :

(V-e)

en la que R2, R3Y R4, son como se han definido en la reivindicación 8, 10 cada AA es independientemente un aminoácido natural y XZ es CH2CH2NHC (=O) (CH2) 2-5 o C (=O) (CH2n.5

10. La molécula enlazadora de compuesto de acuerdo con la reivindicación 9 que tiene una estructura representada por la fónnula (V-d) :

Ã?l O Y ~_"R" O

(V-d)

'-.~"1r~"~~~"" lrN

I O ", R" sJl H "

en la que R13 es Me, n-Pr, CH20Me o CH20C (=O) CH2CH{Me) 2; R'4 es Me o C (=O) Me; Res H o alquilo C, -Cs; R'6 es {CH2) .¡NH2 o (CH2) 3NHC (=O) NH2; R17 es C (Meh o Me; y p es Oo 1. 20

11. La molécula enlazadora de compuesto de acuerdo con la reivindicación 8 que tiene una estructura representada por una de las fónnulas (VI-a) a (VI-t)

(VI-a)

(] H O Y Ij>Jl O

'-fyN, ., (l~~N~) lN

J

O ""''1 I 5 H

(VI-b) H (~H, ) .NH, N ' O r ('NH O

O A , ~

(] H Y Ij>~ O

O O (CH2J. N, y-h

'-r'yN", (l~~NJN O '

O H

", 0'1 I 5J O, H

(VI-c)

(] H O Y r:¡/ O

'-fyN". (l~~N~) lN

O J 5 H

""''1 J co.H

(VI-d) H (~H, J.NH2 N '

<Y I r ('NH O

HO O/ O"" OA

I Nl. " I N Co, H

O ~, ., . S IJ H O •

O

I '

(VI-e)

\10

H O"" O Phe 0

O

N'" N, N H O O Y

(V1-f) H <<:H, ) , NH,

N .

O [f'NH O

í) ~, _ O Y ~~ O ;C~ OOA<CH'I._N>

'y'y . (N~N¡'-) (N •

CO, H O

I O , , -_ I 5J H

(VI·i) H, N O

/'

H O O O H O H HN O 'O .. , st HO-HO A

~ ~~ O

(VI-k)

H o o N o~~.......CO, H o

0. N" (NM ".NrJl.~ O'o/' (CH, ) , -N.IIr

"y'[r 'I SJ O ~ ~ O I -r,

I O "~, o VN~NH O

,

H (CH, ) .NH,

(VI-m)

CO, H

(VI-o)

Co, H (VI-p)

N'" N' •.~ O O

QyH º M:r

IN '

O., . I ", N

\' , SIJ H

C02H

(V1·q)

CONH2 (VI-;') H

H2N N

r'l .

, v ~~Jl ~

'" I 1 ('~ (CH2h-Nn-3

O

OH

O

(VI-s)

NH~

o y

(VI-t)

í) ~~OMAC o

"y ''y'' y

I N · :. '

º , , , O ~ S!. ~ 5

La molée I acuerdo a relvlndlcaclon 8 presentada •

u a enlazad con I

por la fórmula (VI-o) ora de compuesto de (VI-o) qoe I, eoeooa e, 'rue'"a , e YuH º MJl

N"I N..~N N O

O "., . l. ;y~

CO, H

O~

13. La molécula enlaza e acuerdo I que llene una es! ructura representada

-t) 000 a , ei, iodicaeióo 8 . .

por la fórmula (VI-t) dora de compuesto d (VI O "" ~ ¡CH2hNH-1:-NH, . ¡ ('NH º

O 0X1r (CH2) . N?

O

Co, H

14. Un conjugado que comprende la molécula enlazadora de compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 conjugada a un ligando mediante el producto de adición nucleófila de un grupo sulfhidrilo del ligando y el grupo maleimida de la molécula enlazadora de compuesto, en donde el ligando se selecciona entre anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y miméticos de anticuerpo.

15. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la molécula enlazadora de compuesto tiene una

estructura representada por la siguiente fórmula: O

"

(CH, hNH-C-NH,

H -O Ny-'NH

(Ã? H Oy<¡>Ac O

'-'f'yN"r~~N, ) C~ 1 O "" '1 ~ sJl Co, H Ab

en la que Ab representa el anticuerpo anti-mesotelina monoclonal humano 6A4 que tiene la secuencia de la región variable de cadena pesada:

QVHL VESGGGVVQPGRSLRLSCV ASGITFRIYGMHWVRQAPGKGLEWV A VL WY

DGSHEYYADSVKGRFrISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAIYY CARDGDYYDSGS

PLDYWGQGTL VTVSS

Y la secuencia de la región variable de cadena ligera:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT

GIPARFSC;SGSGTDFTL TISSLEPEDF A VYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK,

16. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un conjugado de acuerdo con la 20 reivindicación 14 o la reivindicación 15, para su uso en el tratamiento de un cáncer.

17. Un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula (VIII-a)

NO,

(VIn-a)

R'HN

CO, R'

en la que R1 es H o un grupo protector de amina y R8 es H, alquilo Cl-CID, alquenilo Cr Clo, alquinilo C2-C lO, arito, cicloalifático, alquilcicloalifático, arilalquilo o alquilarilo.

18. Un compuesto que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula (VIlI-b)

NHR'

(VIII-b)

C02R"

en la que R9 y R10 son independientemente H o un grupo protector de am ina y R11 es H, alquilo Cl-C1D, alquenilo C2-C lO, alquinilo Cr ClO, arilo, cicloalifático, alquilcicloalifático, arilalquilo o alquilarilo.