COMPOSICIONES PARA MEJORAR EL TRANSPORTE Y LA EFICACIA ANTISENTIDO DE ANÁLOGOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN CÉLULAS.

Un método para mejorar la capacidad de un oligómero antisentido de morfolino para unirse a una secuencia diana en un ácido nucleico,

según se pone de manifiesto por (i) una disminución en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un codón de iniciación de la traducción de la proteína codificada, o ii) un aumento en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un sitio aberrante de corte y empalme en un pre-mARN que codifica dicha proteína cuando se corta y empalma correctamente, y donde el oligómero antisentido está compuesto por subunidades de morfolino enlazadas mediante uniones que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente, y que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, comprendiendo dicho método la conjugación al oligómero antisentido de un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de las secuencias (RRY)x ó (RYR)x, donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)-(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/013660.

Solicitante: AVI BIOPHARMA, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: SUITE 200, 4575 S.W. RESEARCH WAY CORVALLIS, OR 97333 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: IVERSEN, PATRICK, L., STEIN,DAVID,A, MOULTON,HONG,M, NELSON,MICHELLE,H, KROEKER,ANDREW,D.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 29 de Abril de 2004.

Fecha Concesión Europea: 1 de Septiembre de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K47/48R2
  • C12N15/113 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido.
  • C12N15/87 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.

Clasificación PCT:

  • C12N15/87 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.

Clasificación antigua:

  • C12N15/87 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando procedimientos no previstos en otro lugar, p. ej. cotransformación.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

COMPOSICIONES PARA MEJORAR EL TRANSPORTE Y LA EFICACIA ANTISENTIDO DE ANÁLOGOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN CÉLULAS.

Fragmento de la descripción:

La invención se refiere a métodos para mejorar el suministro de moléculas, por ejemplo, agentes biológicos, dentro de las células, y en particular al suministro intracelular y la unión mejorada de análogos de ácidos nucleicos sustancialmente sin carga, particularmente oligómeros de morfolino con enlaces fosforodiamidato.

Referencias

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Antecedentes de la Invención

La utilidad práctica de muchos fármacos con actividad biológica potencialmente útil se ve a menudo bloqueada por la dificultad de suministro de tales fármacos a sus dianas. Los compuestos que se han de suministrar dentro de las células deben generalmente suministrarse desde un entorno extracelular en su mayor parte acuoso y penetrar seguidamente una membrana celular lipofílica para poder entrar en la célula. A menos que la sustancia sea transportada activamente mediante un mecanismo de transporte específico, muchas moléculas, particularmente moléculas grandes, son muy lipofílicas para solubilizarse en la práctica, o son demasiado hidrófilas para penetrar la membrana.

Un segmento de la proteína Tat del HIV que consiste en los restos de aminoácido 49-57 (Tat 49-57, que tiene la secuencia RKKRRQRRR) se ha utilizado para suministrar péptidos y proteínas biológicamente activos a células (por ejemplo, Barsoum et al., 1994, Publicación PCT Nº WO 94/04686). Tat (49-60) se ha utilizado para mejorar el suministro de oligonucleótidos fosforotioato (Astriab-Fisher, Sergueev et al. 2000; Astriab-Fisher, Sergueev et al. 2002). Se ha publicado que la Tat inversa, o rTat (5749) (RRRQRRKKR), suministra fluoresceína dentro de las células con una eficacia mejorada en comparación con Tat (49-57) (Wender, Mitchell et al. 2000; Rothbard, Kreider et al. 2002). Rothbard y Wender han descrito también otros polímeros de transporte ricos en arginina (Publicación PCT Nº WO 01/62297; Patente de los EE.UU. Nº 6,306,993; Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. Nº 2003/0032593).

Los oligonucleótidos son una clase de compuestos farmacológicos potencialmente útiles cuyo suministro ha sido con frecuencia un impedimento para su uso terapéutico. Se ha descubierto que los oligómeros de morfolino con enlaces fosforodiamidato (PMOs, del inglés “phosphorodiamidate-linked morpholino oligomers”, véase, por ejemplo, Summerton y Weller, 1997) son más prometedores a este respecto que los análogos de oligonucleótidos con carga tales como los fosforotioatos. Los PMOs son moléculas antisentido solubles en agua, sin carga o sustancialmente sin carga, que inhiben la expresión génica impidiendo la unión o progresión de los componentes de la maquinaria de corte y empalme, o traslacional. También se ha demostrado que los PMOs inhiben o bloquean la replicación viral (Stein, Skilling et al. 2001; McCaffrey, Meuse et al. 2003). Son muy resistentes a la digestión enzimática (Hudziak, Barofsky et al. 1996). Los PMOs han demostrado tener una alta especificidad y eficacia antisentido in vitro en modelos libres de células y de cultivos celulares (Stein, Foster et al.

1997; Summerton y Weller, 1997), e in vivo en embriones de pez cebra, rana y erizo de mar (Heasman, Kofron et al. 2000; Nasevicius y Ekker, 2000), así como en modelos animales adultos, tales como ratas, ratones, conejos, perros y cerdos (véanse, por ejemplo, Arora e Iversen 2000; Qin, Taylor et al. 2000; Iversen 2001; Kipshidze, Keane et aI. 2001; Devi 2002; Devi, Oldenkamp et al. 2002; Kipshidze, Kim et al. 2002; Ricker, Mata et al. 2002).

Se ha demostrado que los oligómeros PMO antisentido se incorporan a las células y son más consistentemente eficaces in vivo, con menos efectos inespecíficos, que otros oligonucleótidos antisentido generalmente utilizados (véase, por ejemplo, P. Iversen, "Phosphoramidite Morpholino Oligomers", en Antisense Drug Technology, S.T. Crooke, ed., Marcel Dekker, lnc.,...

 


Reivindicaciones:

1. Un método para mejorar la capacidad de un oligómero antisentido de morfolino para unirse a una secuencia diana en un ácido nucleico, según se pone de manifiesto por (i) una disminución en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un codón de iniciación de la traducción de la proteína codificada, o ii) un aumento en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un sitio aberrante de corte y empalme en un pre-mARN que codifica dicha proteína cuando se corta y empalma correctamente, y donde el oligómero antisentido está compuesto por subunidades de morfolino enlazadas mediante uniones que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente, y que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, comprendiendo dicho método la conjugación al oligómero antisentido de un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de las secuencias (RRY)x ó (RYR)x, donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)-(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7.

20 2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero de morfolino se conjuga a dicho péptido mediante un resto enlazador.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho aminoácido neutro es ácido 6-aminohexanoico.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el péptido tiene la fórmula (RYR)4.

25 5. El método de la reivindicación 1, en el que el péptido tiene la fórmula (RRY)4, y el análogo de ácido nucleico se enlaza a una subunidad Y terminal.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dichas subunidades de morfolino están unidas por uniones de tipo fosforodiamidato sin carga, conforme a la estructura:

**(Ver fórmula)**

donde Y1=O, Z=O, Pj es un resto de purina o pirimidina que forma pares de bases eficaz para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi, o alquilamino incluyendo dialquilamino.

7. Un oligómero antisentido de morfolino compuesto por subunidades de morfolino enlazadas por uniones que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente, y que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, y enlazado covalentemente al oligómero antisentido, un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de las secuencias (RRY)x ó (RYR)x, donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)-(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7.

8. Un método para mejorar la incorporación celular de un oligómero antisentido de morfolino, comprendiendo el método conjugar con el agente un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de las secuencias (RRY)x ó (RYR)x, donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7.

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho oligómero de morfolino se conjuga a dicho péptido mediante un resto enlazador.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que dicho 20 aminoácido neutro es ácido 6-aminohexanoico.

11. El método de la reivindicación 8, en el que el péptido tiene la fórmula (RYR)4.

12. El método de la reivindicación 8, en el que el péptido tiene la fórmula (RRY)4, y el análogo de ácido nucleico se enlaza a una subunidad Y terminal.

13. El método de la reivindicación 8, en el que dichas subunidades de morfolino 25 están unidas por uniones de tipo fosforodiamidato sin carga, conforme a la estructura:

**(Ver fórmula)**

donde Y1=O, Z=O, Pj es un resto de purina o pirimidina que forma pares de bases eficaz para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi, o alquilamino incluyendo dialquilamino.


 

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