Compartimentación de polipéptidos recombinantes en células anfitrionas.

Célula anfitriona que comprende por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales

, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de ésta, siendo la célula anfitriona una célula de bacteria gram negativa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2000/000686.

Solicitante: PROF. DR. LUBITZ, WERNER.

Nacionalidad solicitante: Austria.

Dirección: HAUPTSTRASSE 88 3420 KLOSTERNEUBURG/KRITZENDOR AUSTRIA.

Inventor/es: PROF. DR. LUBITZ,WERNER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K39/00 (Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/04 (Péptidos o polipéptidos cíclicos o puenteados, p. ej. bacitracina (ciclados solamente por enlaces — S — S — C12P 21/02))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/62 (Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/31 (Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/39 (caracterizados por los aditivos inmunoestimulantes, p. ej. por los adyuvantes químicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/70 (Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen sustancias... > A61K35/74 (Bacterias (uso terapéutico de una proteína de la bacteria A61K 38/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/54 (Transferasas (2))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/10 (Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/19 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C... > Microorganismos > C12R1/19 (Escherichia coli)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/15 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/32 (de Bacillus (G))

PDF original: ES-2528330_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Compartimentación de polipéptidos recombinantes en células anfitrionas El presente invento se refiere a unas células anfitrionas de bacterias gram negativas, que comprenden por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte, como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos celulares, p.ej. en el citosol, en la membrana citoplasmática, en el periplasma y en la membrana externa, así como a unos procedimientos para su producción. Las células conformes al invento se adecuan en particular como unos biorreactores para la realización de cascadas de reacciones enzimáticas, en cuyos casos es ventajosa o necesaria una compartimentación de unas enzimas individuales.

La utilización de células vivas como "reactores enzimáticos" para la preparación de sustancias biológicas, p.ej. de poli (hidroxi-ácidos grasos) , tiene una gran importancia para la industria biotecnológica. Para esto es conocido el recurso de introducir y expresar ciertos genes ajenos en una célula anfitriona, con el fin de obtener de este modo una célula anfitriona con enzimas recombinantes, que está en la situación de sintetizar un producto deseado. Una desventaja de los procedimientos conocidos residía, sin embargo, en el hecho que las enzimas producidas en las células anfitrionas mediante una expresión de los genes ajenos no eran estables, eran demasiado poco activas o estaban presentes en una cantidad demasiado pequeña. Se presentaron unas dificultades especiales también en el caso de la realización de unas reacciones de múltiples etapas, en las cuales unos substratos o unos productos de una de las etapas pueden repercutir negativamente sobre otras etapas.

La misión del presente invento fue allanar por lo menos parcialmente los problemas del estado de la técnica y poner a disposición unas células anfitrionas, que estén en la situación de presentar de un modo estable unos polipéptidos recombinantes funcionales y llevar a cabo en particular unas reacciones enzimáticas de múltiples etapas.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante la puesta a disposición de una célula anfitriona de bacterias gram negativas, que comprende por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta como una fusión de un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de ésta.

De manera sorprendente, se comprobó que la expresión recombinante fijada a un soporte de unos polipéptidos heterólogos en diferentes compartimentos de células de bacterias gram negativas conduce a una presentación estable de los polipéptidos heterólogos en una forma funcional (es decir activa inmunológica o/y biológicamente, p.ej. activa enzimáticamente) . Cuando la célula anfitriona es una célula de bacteria gram negativa, los compartimentos celulares se pueden escoger de manera preferida entre el citosol, la membrana citoplasmática (los lados externo e interno) y la membrana externa (los lados externo e interno) .

Las proteínas recombinantes funcionales que se presentan en la célula anfitriona, son de manera preferida cooperativas, es decir que ellas cumplen una función inmunológica o/y biológica común, p.ej. como unas enzimas en una cascada de reacciones de múltiples etapas.

Por lo menos uno, de manera preferida varios, de los polipéptidos recombinantes funcionales se presentan en una forma fijada a un soporte, por ejemplo en forma de unos polipéptidos de fusión y contienen por lo menos un dominio funcional y por lo menos un dominio de soporte. Unas formas preferidas de polipéptidos fijados a un soporte son unas estructuras de capa S (= superficial) (unos polipéptidos de fusión con unos dominios de soporte de capa S) , unos polipéptidos fijados a membranas (unos polipéptidos de fusión con unos dominios de soporte que se integran en membranas) o/y unos componentes de estructuras de fagos recombinantes. En el caso de que sea necesaria una exportación de los polipéptidos funcionales desde el citosol a otros compartimentos de la célula, la expresión se efectúa en común con unos apropiados dominios de dirección hacia un objetivo, que hacen posible una exportación al compartimento celular que se desee en cada caso. Unos ejemplos de unos dominios de dirección hacia un objetivo son unas secuencias de péptidos de señal o/y unas secuencias ayudadoras, que hacen posible el paso a través de membranas.

Conforme al invento, por lo menos uno de los polipéptidos fijados a un soporte está presente en forma de una estructura de capa S recombinante. Las capas S son unas proteínas cristalinas bacterianas situadas en la superficie de las células, que están constituidas por unas unidades idénticas, que se ensamblan consigo mismas. Unos datos genéticos y unas informaciones acerca de las secuencias para diferentes genes de capas S procedentes de microorganismos se indican por ejemplo en la cita de Peyret y colaboradores (Mol. Microbiol. 9 (1994) , 97-109) .

Unos preferidos genes de capas S son los genes sbsA y sbsB de B. stearothermophilus PV72. Las secuencias de estos genes se indican, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 9728263. Allí, se divulga también la producción de una proteína recombinante de fusión de capa S en el citoplasma de células anfitrionas gram negativas. La solicitud de patente internacional WO 9906567 y el documento de Szostak M.P. y colaboradores

(1997) , Behring Inst. Mitt. nº 98, 191-196, describen, por su parte, la producción de una proteína de capa S recombinante en diferentes compartimentos de células de bacterias gram negativas. En lo que respecta a la construcción de unos genes de capa S recombinantes y a la producción de unas adecuadas construcciones artificiales de expresión se hace mención expresamente a estas dos citadas solicitudes de patentes internacionales. Allí no se encuentra, sin embargo, ninguna mención acerca de la expresión concomitante (coexpresión) de dos polipéptidos recombinantes funcionales diferentes.

De modo sorprendente se comprobó que es posible realizar una expresión concomitante (Coexpresión) simultánea o/y secuencial de varias proteínas de capa S recombinantes, eventualmente en combinación con otras proteínas heterólogas, p.ej. en diferentes compartimentos de unas células anfitrionas, en particular de células de bacterias gram negativas.

La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína SbsA madura se indica en la SEQ ID No. 1 desde la posición 91 hasta la 3.684. La pertinente secuencia de aminoácidos se representa en la SEQ ID No. 2. La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína SbsB madura se indica en la SEQ ID No. 3 desde la posición 94 hasta la 2.763. La pertinente secuencia de aminoácidos se representa en la SEQ ID No. 4.

En una primera forma de realización preferida (sbsA) , el ácido nucleico que codifica el dominio de soporte de un polipéptido funcional, se escoge entre

(i) un ácido nucleico, que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID No. 1 desde la posición 91 hasta la 3.684,

(ii) un ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde al ácido nucleico procedente de (i) dentro del marco de la degeneración del código genético, y

(iii) un ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con los ácidos nucleicos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Célula anfitriona que comprende por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de ésta, siendo la célula anfitriona una célula de bacteria gram negativa.

2. Célula de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que los compartimentos se escogen entre el citosol, los lados externo e interno de la membrana citoplasmática, el espacio periplasmático y los lados externo e interno de la membrana externa.

3. Célula de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que varios de los polipéptidos recombinantes están presentes en una forma fijada a un soporte.

4. Célula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizada por que están presentes otros polipéptidos fijados a un soporte en forma de estructuras de capa S, como unos polipéptidos fijados a membranas o/y como unos componentes de estructuras de fagos recombinantes.

5. Célula anfitriona de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizada por que los polipéptidos recombinantes se escogen entre enzimas, citocinas, proteínas que fijan anticuerpos, epítopos que fijan ADN, epítopos antigénicos, alergénicos e inmunogénicos, y estreptavidina.

6. Célula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizada por que los polipéptidos recombinantes son unas enzimas.

7. Célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada por que las enzimas catalizan una reacción enzimática de varias etapas.

8. Célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, caracterizada por que las enzimas catalizan la síntesis de unos poli (hidroxialcanoatos) .

9. Célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 1, realizándose que los por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales cumplen una función inmunológica y/o biológica común.

10. Fantasma de bacteria recombinante, que es obtenible a partir de una célula gram negativa, que comprende por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, de los cuales por lo menos uno se presenta en una forma fijada a un soporte como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos de ésta.

11. Fantasma de bacteria recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, realizándose que los por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales cumplen una función inmunológica y/o biológica común.

12. Procedimiento para la producción de una célula anfitriona de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes 1 hasta 9, caracterizado por que

(a) se pone a disposición una célula anfitriona, que ha sido transformada con por lo menos dos ácidos nucleicos que codifican por lo menos dos diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales, estando unido por lo menos uno de los ácidos nucleicos con una secuencia, que codifica un polipéptido que tiene una estructura de capa S, con el fin de hacer posible una expresión del polipéptido recombinante heterólogo en una forma fijada a un soporte, como una fusión con un polipéptido que tiene una estructura de capa S, estando localizados los diferentes polipéptidos recombinantes heterólogos funcionales en cada caso en diferentes compartimentos celulares de ésta, realizándose que la célula anfitriona es una célula de bacteria gram negativa.

(b) la célula anfitriona se cultiva en unas condiciones tales que dan lugar a una expresión de los ácidos nucleicos y a una producción de los polipéptidos codificados por éstos en una forma funcional.

13. Utilización de una célula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 9 o de un fantasma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 para la producción de una vacuna o un adyuvante.

14. Utilización de una célula anfitriona de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 9 o de un fantasma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 como un reactor enzimático.

FIG.1

Bacteria enzimas exportadas al espacio periplasmático (pe) enzimas ancladas a una membrana (mae) enzimas inmovilizadas en una capa S (sie)

enzimas inmovilizadas en una capa S (sie)

FIG. 2 Bacterias recombinantes con capa S recombinantes

Bacteria enzimas exportadas al espacio periplasmático enzimas ancladas a una membrana enzimas recombinantes basadas en una capa S