Beta-lactamasa modificada y método para su preparación.

Una proteína metalo-beta-lactamasa modificada que tiene la fórmula general:**Fórmula**

en donde

K es lisina

T es treonina

E es ácido glutámico

, y

ΔBL es una proteína metalo-beta-lactamasa que se ha truncado en el extremo amino terminal de manera que dejacuatro cadenas beta antes de la primera hélice alfa de la estructura secundaria predicha de dicha proteína, y lasecuencia E - ΔBL tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidosecuenciales 6-221 de SEQ ID NO:3.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FI2007/050372.

Solicitante: Synthetic Biologics, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 617 Detroit Street Ann Arbor, MI 48104 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: KOSKI,PERTTI, KÄÄRIÄINEN,SUSANNA, WICKSTRAND,NINA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen péptidos... > A61K38/46 (Hidrolasas (3))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/86 (actúan sobre los enlaces amida de las amidas cíclicas, p. ej. penicilinasa)

PDF original: ES-2452321_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Beta-lactamasa modificada y método para su preparación Campo de la invención Se usan varios antibióticos en el tratamiento de infecciones bacterianas. Sin embargo, los antibióticos no solo atacan a patógenos, sino que también afectan a la flora bacteriana normal, llevando a efectos secundarios adversos, por ejemplo, en el intestino del paciente. Estos efectos secundarios pueden reducirse administrando enzimas capaces de degradar el antibiótico residual en el intestino. La presente invención se refiere a metalo-beta-lactamasas modificadas que son útiles en el tratamiento y prevención de efectos adversos de los antibióticos que tienen un anillo beta-lactama, o en la preparación de dichas enzimas. La invención se dirige también a un método para preparar las beta-lactamasas modificadas además de a moléculas de nucleótido, vectores y células huésped útiles en ella.

Fundamento de la invención Las enzimas de beta-lactamasa representan un mecanismo principal de resistencia entre bacterias a antibióticos de beta-lactama, que incluyen penicilinas, cefalosporinas y carbapenemas. Estas enzimas catalizan la hidrólisis irreversible del enlace amida del anillo beta-lactama para crear agentes antimicrobianos inefectivos. En base a la clasificación de estructura molecular y mecanismos catalíticos, las beta-lactamasas pueden dividirse en cuatro clases: A, B, C, y D. Las clases A, C y D son enzimas de serina y comprenden la mayoría de las beta-lactamasas (Ambler, 1980) . Estas enzimas generalmente inactivan penicilinas o cefalosporinas y a menudo muestran una preferencia por uno de estos dos antibióticos.

La clase B de beta-lactamasas son metalo-enzimas que necesitan uno o dos iones de zinc como un cofactor para la actividad enzimática. Las metalo-beta-lactamasas constituyen el grupo 3 en la clasificación funcional de BushJacoby-Madeiros (Bush, 1998) . Este esquema se basa principalmente en perfiles de sustrato, su sensibilidad a EDTA y su resistencia a inhibidores de serina beta-lactamasa. En base a similitudes estructurales en la región que coordina la unión de zinc, las metalo-beta-lactamasas pueden dividirse en tres subgrupos, B1, B2 y B3 (Galleni et al., 2001) . El subgrupo B1 posee tres histidinas y una cisteína como los residuos clave de coordinación al zinc. Las estructuras cristalográficas se han descrito para muchas enzimas del subgrupo B1 como Bcll de Bacillus cereus (Carfi et al, 1995 y 1998a) , CcrA de Bacteroides fragilis y (Carfi et al., 1998b) e IMP-1 de Pseudomonas aeruginosa (Concha et al., 2000) . En la misma medida, las lactamasas del subgrupo B2 tienen un residuo de arginina, en vez de histidina, en la primera posición del motivo principal de unión al zinc, NXHXD. Recientemente, la primera estructura cristalina de una enzima del subgrupo B2 (CphA) se ha resuelto por Garau et al. (2005) . El subgrupo B3 contiene enzimas con estructura multimérica (Walsh et al., 2005) .

Las metalo-beta-lactamasas muestran un perfil de sustrato de amplio espectro que incluyen penicilinas y cefalosporinas, y son resistentes a la acción de inhibidores de serina beta-lactamasa convencionales comunes tales como ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam. Además, a diferencia de la mayoría de las serina betalactamasas, las metalo-beta-lactamasas tienen la capacidad de hidrolizar carbapenemas tales como meropenem e imipenem. Varios números de bacterias se conocen por producir metalo-beta-lactamasas. Se expresan normalmente entre el género Enterobacteriae (que incluye Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freudii, Shigella flexnen) , Pseudomonas aeruginosa, Stenobacterium maltophila, género Acinetobacter, Bacteroides fragilis, Bacillus cereus, Flavobacterium odoratum y Bacteroides fragilis (Walsh et al., 2005) .

Las beta-lactamasas pueden utilizarse como proteínas farmacéuticas para inactivar las beta-lactamas no absorbidas en el tracto gastrointestinal para evitar los efectos adversos inducidos por beta-lactama que incluyen alteraciones en la microbiota normal intestinal y el sobrecrecimiento de bacterias resistentes a la beta-lactama (documentos WO93/13795, WO2004/016248) . Para una terapia eficiente de beta-lactamasa en el tracto del intestino delgado la enzima debería ser resistente a la acción de proteasas intestinales en presencia de ácidos biliares y conservar alta actividad enzimática en un amplio intervalo de pH (5, 5-7, 5) .

La viabilidad de la terapia enzimática dirigida en modelos caninos y de ratón se demostró empleando una serina betalactamasa de Bacillus licheniformis durante la medicación de ampicilina parenteral (Harmoinen et al., 2004, Mentula et al., 2004, Stiefel et al., 2003) . Sin embargo, el perfil de sustrato de esta enzima limita esencialmente su uso como una sustancia farmacológica ya que tiene pobre capacidad para hidrolizar cefalosporinas, carbapenemas o penicilinas en presencia de inhibidores de beta-lactamasa. Por consiguiente, una nueva enzima betalactamasa resistente a proteasa con amplio espectro de beta-lactama es indispensable para extender el uso de la terapia de beta-lactamasa entre los pacientes hospitalizados bajo medicación intravenosa con varias beta-lactamas.

Las metalo-beta-lactamasas se conocen por inactivar varios tipos de beta-lactamas y son resistentes a inhibidores de serina beta-lactamasas. Las cepas de Bacillus cereus se conocen por producir metalo-beta-lactamasa que pertenece al grupo B1. Una muestra de metalo-betalactamasa producida de forma recombinante semi purificada de un aislado clínico de Bacillus cereus 98ME1552 se mostró para eliminar el sobrecrecimiento de bacterias patogénicas potenciales en un modelo de ratón (Stiefel et al., 2005) . Sin embargo, se ha encontrado que este preparado de metalo-beta-lactamasa contenía una mezcla de variantes de beta-lactamasa, que disminuye su valor como una proteína farmacéutica, ya que variaciones de una sustancia farmacológica reduce la solidez del

procedimiento de producción, aumenta las variaciones carga a carga, y hace difícil los ensayos clínicos, lo que por supuesto tiene un impacto negativo en su registro como un medicamento.

Se ha encontrado previamente heterogeneidad también entre betalactamasas de Pseudomonas aeruginosa (Walther-Rasmussen et al., 1999) , mientras no se encontró heterogeneidad del extremo N-terminal en la expresión de metalo-beta-lactamasa de Aeromonas veronii bv. sobria en E. coli (Crawford et al., 2004) . El papel de una extensión amino terminal en una metalo-betalactamasa de Stenotrophomonas maltophilia se describe en Simm et al., 2002. Las beta-lactamasas en estas referencias difieren de las de la presente invención.

La presente invención proporciona actualmente medios para reducir la heterogeneidad amino terminal que se encontró que estaba asociada con la producción recombinante de una metalo-beta-lactamasa. La invención proporciona además metalo-beta-lactamasas modificadas que pueden producirse en forma esencialmente pura y que pueden usarse en la fabricación de composiciones farmacéuticas.

Compendio de la invención La invención proporciona una proteína metalo-beta-lactamasa modificada que tiene la fórmula general:

en donde K es lisina T es treonina E es ácido glutámico, y

ΔBL es una proteína metalo-beta-lactamasa que se ha truncado en el extremo amino terminal de manera que deja cuatro cadenas beta antes de la primera hélice alfa de la estructura secundaria predicha de dicha proteína, y la secuencia E -ΔBL tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácido secuenciales 6-221 de SEQ ID NO:3.

La invención proporciona además una molécula de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína metalo-beta-lactamasa modificada,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una proteína metalo-beta-lactamasa modificada que tiene la fórmula general:

en donde K es lisina T es treonina E es ácido glutámico, y ΔBL es una proteína metalo-beta-lactamasa que se ha truncado en el extremo amino terminal de manera que deja cuatro cadenas beta antes de la primera hélice alfa de la estructura secundaria predicha de dicha proteína, y la secuencia E -ΔBL tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácido secuenciales 6-221 de SEQ ID NO:3.

2. Una molécula de nucleótidos aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína metalo-beta-lactamasa según la reivindicación 1.

3. La molécula de nucleótidos según la reivindicación 2, que comprende los nucleótidos secuenciale.

9. 756 de SEQ ID NO:2.

4. Un vector de expresión que contiene la molécula de nucleótidos según la reivindicación 2.

5. Una célula huésped capaz de expresar la proteína metalo-beta-lactamasa codificada por la molécula de nucleótidos según la reivindicación 2.

6. La célula huésped según la reivindicación 5, que secreta dicha proteína metalo-beta-lactamasa.

7. La célula huésped según la reivindicación 5 o 6, que es Bacillus spp, especialmente B. licheniformis o B. subtilis.

8. Una proteína metalo-beta-lactamasa modificada que tiene la fórmula general

en donde E es ácido glutámico, y

ΔBL es una proteína metalo-beta-lactamasa que se ha truncado en el extremo amino terminal de manera que deja cuatro cadenas beta antes de la primera hélice alfa de la estructura secundaria predicha de dicha proteína, y la secuencia E -ΔBL tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácido secuenciales 6-221 de SEQ ID NO:3.

9. La proteína metalo-beta-lactamasa según la reivindicación 8, que pertenece al subgrupo B1 de metalo-betalactamasas.

10. La proteína metalo-beta-lactamasa según la reivindicación 9, en donde la beta-lactamasa truncada se origina a partir de Bacillus spp., y especialmente a partir de B. cereus.

11. La metalo-beta-lactamasa según la reivindicación 10, en donde E -ΔBL está derivada por la eliminación de los primeros once aminoácidos de amino terminal de una metalo-beta-lactamasa madura.

12. La proteína metalo-beta-lactamasa según la reivindicación 9, en donde la secuencia E -ΔBL tiene al menos 80% de identidad a la secuencia de aminoácidos de residuos de aminoácido secuenciales 6-221 de SEQ ID NO:3.

13. La proteína metalo-beta-lactamasa según la reivindicación 9, en donde la secuencia E -ΔBL es una forma truncada de una metalo-beta-lactamasa que tiene la secuencia descrita como SEQ ID NO:1, o un fragmento activo de beta-lactamasa de la misma.

14. La metalo-beta-lactamasa según la reivindicación 9, en donde E -ΔBL se deriva por truncado de una metalobeta-lactamasa entre los aminoácidos KN y E.

15. Un método para preparar una proteína metalo-beta-lactamasa modificada, comprendiendo dicho método cultivar una célula huésped según la reivindicación 5 bajo condiciones que permiten la expresión de una metalo-betalactamasa que tiene la fórmula general:

en donde K es lisina T es treonina E es ácido glutámico, y ΔBL es una proteína metalo-beta-lactamasa que se ha truncado en el extremo amino terminal de manera que deja cuatro cadenas beta antes de la primera hélice alfa de la estructura secundaria predicha de dicha proteína, y la secuencia E -ΔBL tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácido secuenciales 6-221 de SEQ ID NO:3

y realizar la modificación postraduccional que da por resultado una metalo-beta-lactamasa modificada que tiene la fórmula general:

en donde B y ΔBL son como se definen anteriormente, y opcionalmente aislar y purificar la proteína modificada de forma postraduccional obtenida.

16. El método según la reivindicación 15, en donde la proteína metalo-beta-lactamasa se expresa en una forma que comprende una secuencia de señalización, por lo que la proteína se secreta de la célula huésped.

17. El método según la reivindicación 15 o 16, en donde la proteína se produce en Bacillus spp. especialmente en B. licheniformis o B. subtilis.

18. Una composición farmacéutica que comprende la proteína metalo-beta-lactamasa modificada según la reivindicación 8.

19. La metalo-beta-lactamasa modificada según la reivindicación 8 para usar como un medicamento.

20. El uso de la metalo-beta-lactamasa modificada según la reivindicación 8, para la fabricación de un medicamento por eliminación de los efectos adversos inducidos por antibiótico beta-lactama en el tracto intestinal.

21. El uso según la reivindicación 20, en donde el antibiótico beta-lactama se selecciona del grupo que consiste en cefalosporinas, carbapenemas y penicilinas, cuyo antibiótico se va a eliminar en presencia o ausencia de un inhibidor contra las serina beta-lactamasas.