EN UNA CEPA DE COMAMONAS ACIDIVORANS SE ENCONTRO UNA ENZIMA LACTAMASA QUE TIENE UNA ESTABILIDAD CAPAZ DE HIDROLIZAR UN ENANTIOMETRO DE LACTAMA BICICLICO,

2-AZABICICLO 2.2.1 HEPT-5ENE-3-ONE, PARA OBTENER UNA LACTAMA (-) Y UN AMINOACIDO (+). SE HA AISLADO Y CLONADO LA ENZIMA Y SE HA IDENTIFICADO SU ESTRUCTURA

Microorganismo, enzima lactamasa obtenida a partir del mismo, y su uso.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un microorganismo, la enzima lactamasa obtenida a partir del mismo y su uso.

Antecedentes de la invención

La ?-lactama bicíclica, 2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona es un sintón útil que puede ser usado para la producción de nucleósidos carboxicíclicos que están adquiriendo importancia como agentes terapéuticos. Los sectores publicados para los que estos nucleósidos están siendo dirigidos a diana incluyen antivirales (por ejemplo, Vince y Hua, J. Med. Chem., 33:17-21 (1990), por ejemplo, contra el HIV) y vasodilatadosres cardiacos (agonistas de adenosina). Una ventaja principal del anillo carboxicíclico en estos agentes es su resistencia a la descomposición por enzimas en el cuerpo. A modo de comparación, los nucleósidos de ribosilo que se producen de forma natural pueden ser más fácilmente escindidos por nucleasas, con lo que se pierde su bioactividad.

Aunque los nucleósidos carboxicíclicos son conocidos en la naturaleza, por ejemplo, aristeromicina a partir de Streptomyces citricolor, los rendimientos naturales tienden a ser bajos y los productos aislados tienen que ser a continuación adicionalmente manipulados para obtener compuestos más útiles. Una vía más económica es sintetizar los compuestos necesarios por vía química, partiendo de la ?-lactama. Sin embargo, en forma químicamente sintetizada, la ?-lactama es racémica. Mediante síntesis convencionales, el fármaco final será también una mezcla de enantiómeros, que provoca complicaciones reguladoras si uno de los enantiómeros no es muy activo o provoca efectos secundarios no deseados. Por lo tanto, hay una necesidad de avanzar en la síntesis en la que cualquiera de los dos enantiómeros de un sintón racémico puede ser aislado y el resto del fármaco puede ser seguidamente producido en el mismo.

Una forma eficaz de hacer esto es usar una enzima para hidrolizar selectivamente un enantiómero de la ?-lactama racémica a través del enlace de amida, para proporcionar el compuesto de aminoácido cíclico y dejar el otro enantiómero. La lactama restante puede ser seguidamente separada fácilmente del producto de aminoácido mediante extracción en diclorometano, purificada por cristalización y usada en un tratamiento químico posterior en dirección descendente para producir el fármaco requerido. Mediante la selección cuidadosa de la enzima correcta, es posible encontrar una enzima altamente selectiva para solamente uno de los enantiómeros de lactama, de forma que marginalmente queda una conversión de más de 50% de lactama de ee elevado (> 90%).Las enzimas se ha encontrado que son selectivas para cualquiera de los dos enantiómeros.

El documento EP-A-0424064 describe métodos para llevar a cabo la reducción anteriormente descrita y proporciona dos organismos que producen enzimas que tienen selectividades diferentes. Una cepa de Rhodococcus produce una enzima que hidroliza la (-)-lactama, haciendo posible que la (+)-lactama sea aislada para un uso adicional mientras que una Pseudomona produce una enzima que hidroliza la (+)-lactama, haciendo posible el aislamiento de la (-)-lactama.

Se han descrito también en la bibliografía otras enzimas que llevan a cabo estas hidrólisis selectivas. Así, Taylor et al. Tetrahedron: Asymmetry, 4(6): 1117-1128 (1993), describen una enzima selectiva para la hidrólisis (+)-lactama a partir de Pseudomonas flourescens y una enzima selectiva para la (-)-lactama a partir de una cepa de Aureobacterium. Otra enzima selectiva para la hidrólisis de (+)-lactama ha sido descrita por Brabban et al. J. Ind. Microbiology, 16:8-14 (1996).

Con el fin de desarrollar un procedimiento de biotransformación industrial consistente, es deseable usar una enzima o un biocatalizador celular completo que sea relativamente estable. Esto puede hacer posible el reciclado del biocatalizador y la reutilización a través de una inmovilización, reduciendo así grandemente el coste del biocatalizador y haciendo posible el manejo del biocatalizador a gran escala sin pérdidas significativas de actividad. A menudo se ha encontrado también que los biocatalizadores más estables son más capaces de tolerar concentraciones elevadas de sustrato y/o producto sin inactivación. Esto hace posible seguidamente que las biotransformaciones se realicen a la concentración más elevada posible de reactantes, dadas las restricciones cinéticas y de manejo. Esto tiene dos ventajas: da lugar a unos requisitos mínimos de volumen del reactor y minimiza también los volúmenes de manejo de líquidos durante el tratamiento.

Taylor et al. supra, describen una lactamasa a partir de especies de Aureobacterium que es muy estable a temperaturas elevadas y que hidroliza selectivamente la (-)-?-lactama, proporcionando la (+)-?-lactama y (-)-aminoácido como un producto. La enzima de este organismo ha sido inmovilizada y mantiene su estabilidad durante meses de funcionamiento. No es conocida ninguna enzima con buena estabilidad y la selectividad opuesta, aunque Brabban et al, supra, seleccionaron un número de aislados potenciales diferentes. Un trabajo previo con organismos de tipo Pseudomona que mostraba la actividad requerida de lactamasa les mostró que tenía una solubilidad escasa. Esto es lamentable, ya que la (-)?-lactama que es el sintón más útil, que tiene la estequiometría más natural y que hace más fácil la producción de la funcionalidad que, por ejemplo, el (-)-aminoácido formado mediante la acción de la lactamasa de Aureobacterium. Por lo tanto, hay una necesidad de una ?-lactamasa estable con selectividad elevada para la hidrólisis de la (+)-?-lactama bicíclica.

Sumario de la invención

Sorprendentemente, se ha encontrado que una cepa de Comamonas acidovorans, que fue aislada a partir del medio ambiente, produce una enzima de elevada capacidad potencial para ser usada en un procedimiento industrial para la resolución de la ?-lactama requerida. Esta enzima no solamente es mucho más estable a la temperatura que las (+)-?-lactamasas previamente descritas, sino que hace posible también que la bio-resolución se lleve a cabo a concentraciones muy elevadas de sustrato/producto. Este organismo ha sido depositado en la entidad NCIMB, 23 St. Macyhar Street, Aberdeen, Reino Unido, el 30 de agosto de 1996, bajo las condiciones del Tratado de Budapest, en la que se ha proporcionado el número de acceso NCIMB40827.

El gen que codifica la interrogación-lactamasa ha sido aislado y secuenciado (véase la SEQ ID nº 1). Esta invención se refiere a compuestos que tienen esta estructura y sus fragmentos que tienen la misma actividad, como será fácilmente evidente para un experto en la técnica. La nueva enzima se caracteriza por su estabilidad, es decir:

más de 85% de retención de la actividad después de ser mantenida a 40ºC durante 4 horas o más de 30% de actividad después de ser mantenida a 60ºC durante 4 horas;

hidrólisis a una concentración inicial de 100 g de lactama racémica más 300 ml de tampón y que contiene al menos 90% de hidrólisis de la (+)-lactama con menos de 5% de hidrólisis de la (-)-lactama.

Descripción de la invención

La nueva enzima es útil para la hidrólisis enantioespecífica de una mezcla de enantiómeros de la ?-lactama requerida, por ejemplo, una mezcla racémica. Después de la reacción, la ?-lactama residual puede ser fácilmente separada del (+)-aminoácido formado mediante hidrólisis. Estas dos reacciones se pueden realizar bajo condiciones conocidas por un experto en la técnica.

La enzima puede ser usada en forma de célula completa o aislada. Puede ser inmovilizada, si se desea, mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

La enzima puede ser producida a partir del organismo depositado. Alternativamente, puede ser producida mediante una tecnología recombinante.

Usando el DNA y la secuencia de aminoácidos proporcionados en la presente memoria descriptiva, un experto en la técnica puede construir fácilmente fragmentos o mutaciones de los genes y enzimas descritos en la presente memoria descriptiva. Estos fragmentos y mutaciones, que retienen la actividad de la enzima ilustrada, están dentro del alcance de la presente invención. También, debido a la redundancia del código genético, una diversidad de secuencias diferentes de DNA pueden codificar las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria descriptiva. Está dentro de los conocimientos...

1. Una enzima capaz de hidrolizar un enantiómero de la lactama tricíclica 2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona, teniendo la enzima una estabilidad caracterizada por los apartados (a) y (b)

a) más de 85% de retención de actividad después de ser mantenida 40ºC durante 4 horas o más de 30% de actividad después de ser mantenida a 60ºC durante 4 horas;

b) hidrólisis a una concentración inicial de 100 g de lactama racémica más 300 ml de tampón y continuación hasta 90% de hidrólisis de la (+)-lactama con menos de 5% de hidrólisis de la (-)-lactama,

en que la enzima puede ser obtenida a partir de Comamonas acidivorans NCIMB 40827.

2. Una enzima según la reivindicación 1, que tiene la característica de que la hidrólisis se produce a dicha concentración inicial y continúa hasta de más de 98% de la (+)-lactama con menos de 2% de hidrólisis de la (-)-lactama.

3. Una enzima según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en forma inmovilizada.

4. Una molécula de nucleótido aislada, que codifica una enzima según la reivindicación 1.

5. Una molécula de nucleótido según la reivindicación 4, que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, o un fragmento o mutación de la misma capaz de codificar una enzima según la reivindicación 1.

6. Comamonas acidivorans NCIMB 40827, o un microorganismo transformado con un vector que comprende la molécula de nucleótido de la reivindicación 5.

7. Un método para producir una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende cultivar un microorganismo según al reivindicación 6.

8. Un procedimiento para la hidrólisis esteroselectiva de una mezcla de enantiómeros de 2-azabiciclo[2.2.1]hept-5-en-3-ona, que comprende poner en contacto la mezcla con una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un microorganismo según la reivindicación 6.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, que comprende adicionalmente separar (-)-lactama residual del (+)-aminoácido formado mediante hidrólisis.