ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-NUCLEO DE VHC.
Una línea celular de hibridoma correspondiente al número de la ATCC, PTA-3806
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07075928.
Solicitante: ORTHO-CLINICAL DIAGNOSTICS, INC..
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 100 INDIGO CREEK DRIVE,ROCHESTER, NEW YORK 14650-0880.
Inventor/es: BAHL,CHANDER.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 4 de Noviembre de 2002.
Fecha Concesión Europea: 3 de Marzo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K16/10N1
Clasificación PCT:
- C07K14/18 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Togaviridae, p. ej. Flavivirus, virus de la peste, virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis C, virus de la encefalitis japonesa.
- C07K16/10 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › de virus ARN.
- C12N5/20 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › siendo uno de los integrantes de la fusión un linfocito B.
- G01N33/576 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para la hepatitis.
- G01N33/577 G01N 33/00 […] › en los que interviene anticuerpos monoclonados.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Finlandia, Chipre.
Fragmento de la descripción:
Anticuerpo monoclonal anti-núcleo de VHC.
Antecedentes de la invención
Aproximadamente 170 millones de personas en todo el mundo se han infectado por el virus de la hepatitis C (VHC). En los próximos años, el número de muertes en los EE.UU. por cáncer y enfermedad hepática producida por el VHC puede superar las muertes producidas por el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
La transmisión del VHC parece requerir un contacto sanguíneo. Portando una única hebra de ácido ribonucleico (ARN), el VHC sólo contiene un gen, que codifica un poliproteína que se rompe posteriormente dando al menos 10 proteínas funcionales. Claramente, la capacidad para someter a prueba el aporte de sangre para detectar VHC es de gran importancia. Un ensayo sensible que puede detectar la infección en una fase temprana. Por tanto sería ventajosa la detección tanto de anticuerpos como de antígenos de VHC en un único ensayo.
Los ensayos de detección del núcleo de VHC capturan el antígeno de VHC de las muestras infectadas por VHC sobre una fase sólida revestida con anticuerpos monoclonales anti-núcleo. La proteína del núcleo capturada se detecta mediante una reacción de unión con un anticuerpo monoclonal anti-núcleo marcado con una enzima usando tecnología de inmunoensayo convencional. La disponibilidad de buenos anticuerpos monoclonales frente a múltiples epítopos de antígeno del núcleo de VHC aumentará la sensibilidad de los ensayos de detección del antígeno de VHC. En primer lugar, múltiples anticuerpos aumentan la eficacia de la captura del antígeno de VHC de las muestras sobre la fase sólida. En segundo lugar, el uso de múltiples anticuerpos para la detección aumenta la sensibilidad del sistema proporcionando una señal acumulativa superior. Otra ventaja es que el uso de anticuerpos que reconocen múltiples epítopos en los ensayos permite a los ensayos detectar muestras infectadas con diferentes genotipos del virus VCH.
Sumario de la invención
La presente solicitud describe un anticuerpo monoclonal dirigido contra una región de la proteína del núcleo de VHC.
El epítopo reconocido por este anticuerpo monoclonal tiene 15 aminoácidos ("aa") de longitud. Este anticuerpo es útil para detectar la proteína del núcleo de VHC en pacientes infectados por VHC. Específicamente, este anticuerpo es ventajoso para detectar el VHC en la sangre de seres humanos infectados. Finalmente, este anticuerpo junto con proteínas recombinantes confeccionadas de manera apropiada puede usarse para la detección simultánea de la proteína del núcleo de VHC y anticuerpos anti-VHC.
Los inventores presentes han desarrollado varios anticuerpos monoclonales anti-núcleo de VHC. Estos anticuerpos tienen propiedades únicas porque reconocen secuencias cortas, en la región del núcleo de VHC que no tiene epítopos principales reconocidos por los anticuerpos humanos anti-VHC. Estos anticuerpos pueden ser reactivos útiles para detectar antígeno del núcleo de VHC en muestras de sangre de individuos infectados con el VHC. El reconocimiento de epítopos cortos por estos anticuerpos monoclonales y la ubicación de estas secuencias en la región del núcleo de VHC hace a estos anticuerpos monoclonales muy útiles para el desarrollo de un ensayo de combinación antígeno/anticuerpo de VHC. Para el ensayo de combinación se usan estos anticuerpos monoclonales en combinación con el antígeno del núcleo que se ha modificado para eliminar la capacidad de estos antígenos para unirse a estos anticuerpos monoclonales pero que conservan su capacidad para unirse a anticuerpos humanos anti-VHC. Por tanto, las proteínas del núcleo de VHC usadas para capturar los anticuerpos presentes en el suero infectado no reaccionarán con los anticuerpos monoclonales frente al núcleo de VHC utilizados en la prueba para capturar simultáneamente los antígenos presentes en el suero infectado. Un ensayo de combinación puede detectar una infección por VHC antes que el ensayo de anticuerpos frente a VHC empleado actualmente.
Descripción detallada de la invención
La eficacia y las ventajas de la invención se ilustran de manera adicional mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Inmunógenos
Los inmunógenos utilizados para producir los anticuerpos fueron una proteína recombinante del núcleo de longitud completa ("FLC") (aminoácidos (aa) 1-191); proteína del núcleo de VHC, c22-3, expresada en levadura como un proteína de fusión SOD (aa 1-120); y péptidos sintéticos grandes, tales como ODS243 (aa 70-110); y péptidos de 15 unidades monoméricas conjugados con hemocianina de lapa californiana (KLH) que contienen secuencias de antígeno del núcleo de VHC.
Ejemplo 2
Protocolo de inmunización
Se generaron los anticuerpos usando procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Ed Harlow y David Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor, Capítulo 6. Se inmunizaron ratones con los inmunógenos descritos en el presente documento. Se extrajo la sangre de los ratones y se examinó con varias proteínas recombinantes y péptidos de la secuencia del núcleo de VHC. Se prepararon anticuerpos monoclonales puros mediante cromatografía de afinidad por proteína A. Se determinó la especificidad precisa de los anticuerpos monoclonales uniendo los octapéptidos solapantes contenidos en cada uno de los correspondientes péptidos de 15 unidades monoméricas. Se mapearon la mayor parte de los anticuerpos en una región de 6-8 aminoácidos en la secuencia de proteína del núcleo de VHC.
Ejemplo 3
Caracterización de los anticuerpos
Se caracterizaron los anticuerpos monoclonales mediante ELISA usando péptidos sintéticos solapantes de aproximadamente 15 aa de longitud. Los anticuerpos se caracterizaron adicionalmente para determinar su especificidad precisa mediante ELISA peptídico usando octapéptidos solapantes incluidos en el péptido reactivo de 15 unidades monoméricas. En la tabla siguiente se incluye un resumen de los anticuerpos generados.
La tabla dada a continuación identifica 15 anticuerpos novedosos. Se examinaron los anticuerpos en cada fase de desarrollo del anticuerpo con placas de microtitulación de pocillos recubiertas con inmunógeno. El inmunógeno utilizado para inmunizar los ratones que producían cada cepa de anticuerpo monoclonal se identifica como uno de los siguientes: péptido ODS 243, un péptido grande definido adicionalmente en el ejemplo 1; "FLC" significa antígeno del núcleo de longitud completa, definido en el ejemplo 1; o péptido n° 8 del núcleo conjugado con KLH, un péptido corto, definido adicionalmente en el presente documento. Se muestra la especificidad de cada uno para un péptido enumerado y se identifican en el presente documento las secuencias de aminoácidos de cada péptido enumerado. Además, en la última columna está incluido el epítopo al que se une específicamente el anticuerpo, definido por los aminoácidos que codifican el epítopo.
La tabla a continuación muestra péptidos sintéticos del núcleo de VHC.
La tabla a continuación muestra el rastreo del anticuerpo identificado como PTA-3811 con placas de ELISA revestidas con péptidos del núcleo de VHC.
Mapeo de epítopos del anticuerpo monoclonal PTA-3811 usando octapéptidos solapantes.
El anticuerpo monoclonal 7B4F11 reaccionó con los octapéptidos 8.2, 8.3, 8.4, 8.5 en un ELISA de quimioluminiscencia medido en unidades luminosas arbitrarias (ALU). Basándose en la reactividad de los octapéptidos, el epítopo monoclonal está centrado alrededor de la secuencia PWPL.
Los ejemplos anteriores se desean para ilustrar, pero no para limitar, el alcance y el espíritu de la presente invención.
Reivindicaciones:
1. Una línea celular de hibridoma correspondiente al número de la ATCC, PTA-3806.
2. Un anticuerpo monoclonal secretado por la línea celular de hibridoma según la reivindicación 1.
3. El uso del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2 para detectar antígeno del núcleo de VHC.
4. Kits de ensayo que contienen el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 2.
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