Nuevo tipo de sondas universales para la detección de variantes genómicas.

Composición que comprende un primer juego de sondas y un segundo juego de sondas,

presentando cada una de las sondas ocho nucleótidos, en el que los ocho nucleótidos están compuestos de uno a tres nucleótidos de ADN y cinco a siete nucleótidos de ANB (ácido nucleico bloqueado), en el que todas las sondas del primer y segundo juegos de sondas presentan secuencias de nucleótidos idénticas con la excepción de:

(i) la base o bases en una, dos o tres posiciones aleatorias de ANB, y

(ii) la base en una posición discriminante,

en el que una, dos o tres posiciones aleatorias de ADN y la posición discriminante se encuentran situadas en posiciones idénticas en todas las sondas del primer y segundo juegos, en el que en cada posición aleatoria de ANB la base se selecciona independientemente de entre adenina, citosina, guanina y timina y cualquier posible secuencia resultante de la variación o variaciones de secuencia en una, dos o tres posiciones aleatorias de ANB se encuentra representada por como mínimo una sonda en cada juego de sondas, y

en el que la base en la posición discriminante es idéntica dentro de cada juego de sondas pero difiere entre el primer y el segundo juegos de sondas.

Nuevo tipo de sondas universales para la detecciïn de variantes genïmicas La presente invenciïn se refiere a una composiciïn que comprende un primer juego de sondas y un segundo juego de sondas, compuesto de uno o mïs nucleïtidos de ADN y cinco o mïs nucleïtidos de ANB (ïcido nucleico bloqueado) (o anïlogos de ANB como, por ejemplo, ANE (ïcido nucleico con puente de 2'-O, 4'-C-etileno) o derivados 2'-amino-ANB) , en la que la sonda difiere en una, dos o tres posiciones aleatorias del ANB y la base en una posiciïn discriminante. Ademïs, la presente invenciïn se refiere a un mïtodo para detectar variantes genïmicas mediante las sondas anteriormente indicadas. Ademïs, la invenciïn se refiere a una biblioteca de una pluralidad de sondas.

Es ampliamente conocido que los polimorfismos genïticos desempeïan un papel crucial para la salud y la predisposiciïn a diversas enfermedades en prïcticamente todos los organismos. Los polimorfismos genïticos y las mutaciones pueden presentar un gran impacto sobre el metabolismo del organismo afectado en el caso de que resulte afectado un gen, o pueden permanecer inadvertidas (mutaciïn silenciosa) en el caso de que resulte afectada una parte no codificante del genoma. En general, los polimorfismos genïticos estïn causados por la mutaciïn en un gen. La mutaciïn puede ser una mutaciïn de desplazamiento de marco de lectura, una deleciïn de un gen o de una parte del gen, la repeticiïn de un gen, la inserciïn de un gen o un intercambio de un solo nucleïtido.

La deleciïn de un gen o de una parte del mismo y la alteraciïn del nïmero de copia de un gen conducen a una variante de nïmero de copia (VNC) . Las VNC pueden estar provocadas por reorganizaciones genïmicas, tales como deleciones, duplicaciones y traslocaciones. Las VNC se encuentran asociadas a diferentes tipos de cïncer, tales como, por ejemplo, el cïncer pulmonar de cïlulas no pequeïas, aunque tambiïn asociadas a autismo y a esquizofrenia.

Un intercambio de un solo nucleïtido conduce a un polimorfismo de nucleïtido simple (PNS) . Se asocian numerosas enfermedades a los PNS, tales como, por ejemplo, la anemia falciforme, el trastorno de hipercoagulabilidad asociado a la variante factor V Leiden, la predisposiciïn al asma y el cïncer (por ejemplo los oncogenes) .

Por lo tanto, en particular, los polimorfismos de nucleïtidos simples (PNS) y las variantes de nïmero de copia (VNC) desempeïan un papel crucial.

En consecuencia, las herramientas analïticas para detectar una mutaciïn, en particular una VNC o un PNS, en muestras biolïgicas presentan un gran impacto en la investigaciïn actual, mïs particularmente una VNC o un PNS en muestras de pacientes presentan un gran impacto sobre la medicina actual. En particular, en vista del creciente envejecimiento de la poblaciïn y en un contexto en el que la atenciïn sanitaria y la protecciïn de la salud presentan una creciente importancia, la detecciïn de una predisposiciïn genïtica o de una enfermedad genïtica resulta cada vez mïs importante. Ademïs, el campo todavïa bastante nuevo de la medicina personalizada se basa esencialmente en la detecciïn de los polimorfismos genïticos.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en los ïltimos aïos se han desarrollado varios mïtodos para detectar polimorfismos de nucleïtidos simples (PNS) y variantes de nïmero de copia (VNC) . Por ejemplo, los polimorfismos genïticos pueden detectarse mediante mïtodos tales como, por ejemplo, la secuenciaciïn del gen de interïs, la extensiïn de bases individuales (EBI) , las micromatrices de ïcido desoxirribonucleico (ADN) , tales como, por ejemplo, una matriz de PNS o un chip AffymetrixTM, la PCR basada en sondas TaqManï, la hibridaciïn genïmica comparativa basada en matrices o la hibridaciïn in situ comparativa.

El documento nï WO 2004/1135 da a conocer bibliotecas de sondas de ANB en las que se encuentran cubiertas todas las posibilidades de secuencia. Las sondas con secuencias definidas se utilizan en ensayos de detecciïn de polimorfismos, entre otros ensayos. El documento nï WO 2004/113563 no proporciona composiciones con sondas que comprenden nucleïtidos de ANB aleatorizados segïn las reivindicaciones.

Sin embargo, para la totalidad de los mïtodos anteriormente inidcados, se requiere la sïntesis de sondas altamente especïficas. De esta manera, para cada locus potencial de un polimorfismo o de una mutaciïn, deben sintetizarse por lo menos dos sondas altamente especïficas representantes de dos genotipos diferentes y compararse entre sï. En consecuencia, para cada alelo en cuesiïn debe sintetizarse individualmente una sonda. Por lo tanto, el anïlisis de numerosos loci polimïrficos potenciales en un experimento requiere mucho tiempo, y es laborioso y caro. Para algunos de los mïtodos anteriormente indicados, ademïs debe marcarse cada sonda. Este procedimiento de marcaje nuevamente requiere mucho tiempo, y es laborioso y caro. Otros mïtodos, tales como los mïtodos basados en matrices, proporcionan miles de diferentes variantes pero resultan difïciles de analizar y no proporcionan resultados cuantitativos. Ademïs, estos mïtodos no consiguen detectar mutaciones desconocidas. Con el fin de conseguir una especificidad elevada, las sondas deben presentar una determinada longitud mïnima. En

consecuencia, las sondas con una especificidad elevada son comparablemente largas y, por lo tanto, resultan difïciles de sintetizar. Ademïs, dichas sondas largas con frecuencia no consiguen detectar los polimorfismos de nucleïtidos simples (PNS) debido a que las diferencias racionales entre un apareamiento total y un ïnico desapareamiento son excesivamente pequeïas.

Por otra parte, existen mïtodos para la cuantificaciïn de los niveles de expresiïn. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una reacciïn en cadena de la polimerasa (PCR) en un ciclador de PCR en tiempo real, tal como, por ejemplo, un LightCyclerï. La PCR tambiïn puede ser una PCR de transcriptasa inversa. Ademïs, la PCR que se lleva a cabo en un ciclador de PCR en tiempo real puede combinarse con pigmentos de ADN intercalantes, tales como, por ejemplo, SYBR Green I, o con una sonda marcada, tal como una sonda especïfica o semiespecïfica. Ademïs, dicha sonda semiespecïfica puede ser, por ejemplo, una sonda Universal Probe Librar y TM (UPL) . Una UPL consiste de sondas que comprenden nucleïtidos de ANB (ïcido nucleico bloqueado) en lugar de nucleïtidos de ADN. Las sondas estïn diseïadas de manera que se unen a numerosas dianas. Algunas de las sondas se unen a mïs de 7.000 transcritos en un ïnico transcriptoma. Sin embargo, los mïtodos basados en dichas sondas no consiguen regularmente detectar o cuantificar mutaciones definidas. Por lo tanto, la utilizaciïn de una sonda semiespecïfica, tal como, por ejemplo, una sonda UPL, no consigue unirse a un locus definido especïficamente.

Por lo tanto, todavïa existe una necesidad no satisfecha de una sonda que consista de una cadena de ïcidos nucleicos corta que pueda, por una parte, utilizarse universalmente para la detecciïn de diversas secuencias diana y que sea, por otra parte, especïfica de alelo y permita la detecciïn de una mutaciïn especïfica, en particular de un polimorfismo de nucleïtido simple (PNS) .

En el contexto de la presente invenciïn, se proporciona un juego de sondas que comprende nucleïtidos de ADN y de ANB. Preferentemente, en el extremo 5', las nucleobases se encuentran determinadas, mientras que en el extremo 3', existen uno o mïs, preferentemente dos o tres, nucleïtidos aleatorios (posiciones tambaleantes) . Este diseïo de sonda permite que un nïmero controlable de sondas resulte suficiente para la aplicaciïn a una multitud de problemas.

Inesperadamente, al utilizar el juego de sondas definido en la presente memoria, las sondas de uniïn a dianas especïficas resultaron suficientes para discriminar diferentes alelos de mutaciones especïficas, en particular polimorfismos de nucleïtidos simples (PNS) . Concomitantemente, cada juego de sondas puede utilizarse inesperadamente para muchos genes diana diferentes para detectar los PNS.

Un primer aspecto de la presente invenciïn se refiere a una composiciïn que comprende un primer juego de sondas y un segundo juego de sondas, presentando cada una de las sondas ocho nucleïtidos, en el que los ocho nucleïtidos estïn compuestos de uno a tres nucleïtidos de ADN y cinco a siete nucleïtidos de ANB (ïcido nucleico bloqueado) , en el que todas las sondas del primer y segundo juegos de sondas presentan secuencias de nucleïtidos idïnticas con la excepciïn de:

(i) la base o bases en una, dos o tres posiciones aleatorias de ANB, y

(ii) la base en una posiciïn discriminante,

en el que la posiciïn... [Seguir leyendo]

1. Composiciïn que comprende un primer juego de sondas y un segundo juego de sondas, presentando cada una de las sondas ocho nucleïtidos, en el que los ocho nucleïtidos estïn compuestos de uno a tres nucleïtidos de ADN y cinco a siete nucleïtidos de ANB (ïcido nucleico bloqueado) , en el que todas las sondas del primer y segundo juegos de sondas presentan secuencias de nucleïtidos idïnticas con la excepciïn de:

(i) la base o bases en una, dos o tres posiciones aleatorias de ANB, y

(ii) la base en una posiciïn discriminante, en el que una, dos o tres posiciones aleatorias de ADN y la posiciïn discriminante se encuentran situadas en posiciones idïnticas en todas las sondas del primer y segundo juegos, en el que en cada posiciïn aleatoria de ANB la base se selecciona independientemente de entre adenina, citosina, guanina y timina y cualquier posible secuencia resultante de la variaciïn o variaciones de secuencia en una, dos o tres posiciones aleatorias de ANB se encuentra representada por como mïnimo una sonda en cada juego de sondas, y en el que la base en la posiciïn discriminante es idïntica dentro de cada juego de sondas pero difiere entre el primer y el segundo juegos de sondas.

2. Composiciïn segïn la reivindicaciïn 1, en la que la posiciïn discriminante se encuentra en la posiciïn 2, 3, 4, 5, 6 ï 7 desde el extremo 5' en cada sonda, preferentemente en la posiciïn 3, 4 ï 5, mïs preferentemente en la posiciïn 4.

3. Composiciïn segïn la reivindicaciïn 1 ï 2, en la que el nucleïtido en la posiciïn 1 desde el extremo 5' es un nucleïtido de ADN.

4. Composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que cada sonda consiste de:

- un nucleïtido de ADN y siete nucleïtidos de ANB,

- dos nucleïtidos de ADN y seis nucleïtidos de ANB, o

- tres nucleïtidos de ADN y cinco nucleïtidos de ANB.

5. Composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, a) en la que el juego de sondas presenta una posiciïn aleatoria de ANB en la posiciïn 5, 6, 7 ï 8 desde el extremo 5', o b) en la que el juego de sondas presenta dos posiciones aleatorias de ANB en las posiciones 5 y 6, 5 y 7, 5 y 8, 6 y 7, 6 y 8, ï 7 y 8 desde el extremo 5', preferentemente en las posiciones 7 y 8, o c) en el que el juego de sondas presenta tres posiciones aleatorias de ANB en las posiciones 5, 6 y 7, 5, 6 y 8, ï 6, 7 y 8 desde el extremo 5', preferentemente en las posiciones 6, 7 y 8.

6. Composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las sondas presentan la estructura general 5’-D -L -L -L -L -X -X -X-3', en la que D es un nucleïtido de ADN, cada L es un nucleïtido de ANB y cada X es una posiciïn aleatoria de ANB.

7. Composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las sondas presentan la estructura general 5’-D -L -L -L -L -L -X -X -3', en la que D es un nucleïtido de ADN, cada L es un nucleïtido de ANB y cada X es una posiciïn aleatoria de ANB.

8. Composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que las sondas del primer juego de sondas se marcan con un primer marcador y las sondas del segundo juego de sondas se marcan con un segundo marcador, en los que el primer marcador es diferente del segundo marcador.

9. Composiciïn segïn la reivindicaciïn 8, en la que el primer y el segundo marcadores son marcadores fluorescentes.

10. Composiciïn segïn la reivindicaciïn 9, en la que las sondas son sondas de hidrïlisis marcadas adicionalmente con un inhibidor.

11. Mïtodo para determinar el genotipo en un locus de interïs en una muestra obtenida de un sujeto,

comprendiendo el mïtodo: a) poner en contacto la muestra que comprende material genïtico con la composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y b) detectar la uniïn de una sonda del primer o del segundo juego de sondas al material genïtico, determinando de esta manera el genotipo en el locus.

12. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 11, en el que el locus es un ïnico nucleïtido.

13. Mïtodo segïn la reivindicaciïn 11 ï 12, en el que el mïtodo comprende: a) llevar a cabo una etapa de amplificaciïn que comprende la puesta en contacto de la muestra con un juego de cebadores con el fin de producir un producto de amplificaciïn que incluye el locus de interïs, b) llevar a cabo una etapa de hibridaciïn que comprende poner en contacto el producto de amplificaciïn de la etapa a) con la composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y c) detectar la hibridaciïn de una sonda del primer o segundo juego de sondas con el material genïtico, determinando de esta manera el genotipo en el locus.

14. Mïtodo segïn las reivindicaciones 11 a 13, en el que:

(i) la detecciïn se realiza mediante la mediciïn de la presencia o ausencia de fluorescencia,

(ii) la detecciïn se realiza en tiempo real,

(iii) el marcador se selecciona de entre el grupo que consiste de fluoresceïna, LC-amarillo 555, FAM, VIC, HEX, rodamina-B, rodamina-6G, LC-rojo 610, LC-rojo 640, LC-rojo 670, LC-rojo 705, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y un inhibidor,

(iv) la etapa de amplificaciïn utiliza un enzima polimerasa que presenta actividad de exonucleasa 5' a 3', y/o

(v) la muestra es una muestra biolïgica, preferentemente una muestra seleccionada de entre el grupo que consise de un lïquido corporal, una

muestra de sangre, una muestra de orina, suero, mucosa, esputo, heces, muestra epidïrmica, muestra de piel, frotis bucal, esperma, lïquido amniïtico, cïlulas en cultivo y muestra de mïdula ïsea.

15. Biblioteca de por lo menos dos juegos de sondas, en la que la biblioteca comprende una pluralidad de juegos de sondas, presentando cada una de las sondas ocho nucleïtidos con la estructura general 5’5’-D-L-L-L-L-LX-X-3’ o 5’-D-L-L-L-L-X-X-X-3’, en las que D es un nucleïtido de ADN, cada L es un nucleïtido de ANB y cada X es un nucleïtido aleatorio de ANB, en el que, dentro de un juego de sondas, todas las sondas presentan secuencias de nucleïtidos idïnticas con la excepciïn de los dos y/o tres nucleïtidos aleatorios de ANB, en el que en cada nucleïtido aleatorio de ANB, la base se selecciona independientemente de entre adenina, citosina, guanina y timina y cualquier secuencia posible resultante de la variaciïn o variaciones de bases en las dos posiciones aleatorias se encuentra representada por una sonda en cada juego de sondas, y

en el que un juego de sondas difiere de otro juego de sondas en la secuencia de por lo menos el nucleïtido de ADN D o un nucleïtido de ANB L.

16. Biblioteca de juegos de sondas segïn la reivindicaciïn 15,

(i) en la que el nïmero de juegos es de por lo menos 64, preferentemente de 128, especialmente de por lo menos 256, particularmente de por lo menos 512, mïs preferentemente de por lo menos 1.024, todavïa mïs preferentemente de 2.048, y/o

(ii) en el que los juegos de sondas se encuentran separados espacialmente entre sï.