La invención se relaciona con un método in vitro para la detección de bacterias del género Salmonella sp.

mediante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa empleando cebadores específicos para dicho patógeno a partir de muestras de ADN y de ARN de dicho microorganismo. Dicho método resulta de utilidad en la detección de microorganismos viables y no viables de Salmonella sp. en muestras ambientales, clínicas y alimentarias. Asimismo, la invención también se relaciona con un kit para la puesta en práctica de dicho método

Métodos y reactivos para la detección de Salmonella sp.

Campo de la invención

La invención se relaciona con un método in vitro para la detección de bacterias del género Salmonella sp. mediante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa empleando cebadores específicos para dicho patógeno a partir de muestras de ADN y de ARN de dicho microorganismo. Dicho método resulta de utilidad en la detección de microorganismos viables y no viables de Salmonella sp. en muestras ambientales, clínicas y alimentarias. Asimismo, la invención también se relaciona con un kit para la puesta en práctica de dicho método.

Antecedentes

La salmonelosis es una de las enfermedades alimentarias más comunes y más ampliamente extendida, producida por las bacterias del género Salmonella sp. Se ha estimado que Salmonella sp. es responsable de más de 1,4 millones de casos de enterocolitis y de más de 500 muertes al año en Estados Unidos.

El sistema taxonómico actual de Salmonella sp. ha reagrupando todas las cepas de Salmonella sp. (patógenas o no) en dos únicas especies: S. enterica y S. bongori. Ésta última (previamente subespecie V) parece no ser patógena para el ser humano.

La especie S. entérica tiene seis subespecies (a veces como subgrupos bajo numeración romana): enterica (I); salamae (II); arizonae (IIIa); diarizonae (IIIb); houtenae (IV); S. bongori (V), ya incluida en una especie distinta; e indica (VI).

Cada subespecie a su vez, está formada por diversos serotipos, habiéndose identificado hasta la fecha más de 2.500. Una de ellas es S. enterica subsp. enterica (o subgrupo I) se divide en cinco serogrupos: A, B, C, D y E. A su vez, cada serogrupo comprende múltiples componentes, dando lugar a las serovariedades (serotipos).

Con importancia clínico epidemiológica, las más de 2500 serovariedades de Salmonella sp. pueden agruparse en tres divisiones ecológicas (sp. son subespecies):

La detección habitual de este patógeno incluye procedimientos basados en el cultivo y la identificación bioquímica de las colonias. El procedimiento normalizado de trabajo basado en el cultivo requiere siete días para confirmar la presencia de este patógeno en la muestra analizada. Estos procedimientos, aunque eficientes, son demasiado lentos como para poder ser empleados de forma sistemática en un gran número de muestras.

Alternativamente a los procedimientos basados en el cultivo y la identificación bioquímica de las colonias de Salmonella sp., existen numerosas técnicas para la detección de dicho patógeno basadas en la tecnología PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Además, mediante dicha tecnología también es posible detectar células vivas si se parte de ARN para realizar la PCR o células vivas y muertas si se parte de ADN genómico.

La solicitud de patente US6893847 describe oligonucleótidos especialmente diseñados para detectar el ARNm del gen invA de Salmonella sp.

Fey et al. (Applied and Enviromental Microbiology, 2004 vol. 70(6): 3618-3623) han desarrollado un método para la detección de ARN bacteriano en muestras de agua basado en el empleo de una PCR a tiempo real. Para poner a prueba el método desarrollado, emplean el gen invA y el ARNr 16S de Salmonella enterica serovariante Thyphimurium.

Fukushima, H. et al. (Journal of Clinical Microbiology, 2003, vol. 41(11): 5134-5146) describen un ensayo de PCR a Tiempo Real Duplex empleando SYBR Green para la detección de 17 especies de patógenas presentes en agua y comida partiendo de ADN genómico. Entre las especies patógenas detectadas se encuentra Salmonella sp. Para su detección emplean cebadores dirigidos a amplificar el gen invA de Salmonella sp.

Por otro lado, en el estado de la técnica también se han desarrollado métodos que permiten la detección de múltiples especies y serovariantes de Salmonella sp. mediante una única reacción de PCR:

Nam, H. et al. (International Journal of Food Microbiology, 2005, vol. 102: 161-171) describen un ensayo de PCR a Tiempo Real empleando SYBR Green para la detección de distintas especies de Salmonella sp. (ver Tabla 1 de dicha publicación) a partir de ADN. Para ello han diseñado una pareja de cebadores que amplifica de forma específica un fragmento de 119 pb del gen invA de Salmonella.

La solicitud de patente EP0739987 describe un método para la detección de distintas especies de Salmonella sp. a partir de ADN mediante una PCR que comprende el empleo de unos oligonucleótidos dirigidos de forma específica al gen invA de Salmonella sp.

Rahn et al. (Molecular and Cellular probes, 1992 vol. 6: 271-279) describen un método de detección de múltiples especies de Salmonella sp. a partir de ADN que comprende la amplificación de la secuencia del gen invA de Salmonella sp. mediante una reacción en cadena de la polimerasa.

Por tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad desarrollar un método de detección de Salmonella sp. que permita detectar el mayor número serovariantes de dicho patógeno y que sea, a la vez que eficaz, rápido y económico.

Compendio de la invención

En un aspecto la invención se relaciona con un método in vitro para la detección de Salmonella sp. en una muestra que comprende

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para la detección de Salmonella sp. en una muestra que comprende

En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido cuya secuencia se selecciona del grupo de secuencias SEQ ID NO: 2 [cebador INVAVITWO F], SEQ ID NO: 3 [cebador INVAVITWO R], SEQ ID NO: 4 [sonda INVAVITWO], SEQ ID NO: 7 [sonda INVAVITONE].

En otro aspecto la invención se relaciona con un kit que comprende una pareja de cebadores capaz de amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende (i) la pareja de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R] y (ii) una sonda marcada, en donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7 [INVAVITONE].

Por último, el uso de los kits de la invención en la detección de Salmonella sp. constituyen aspectos incluidos dentro del contexto de la presente...

1. Método in vitro para la detección de Salmonella sp. en una muestra que comprende

2. Método según la reivindicación 1, en donde la pareja de cebadores comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la detección del producto de amplificación se lleva a cabo mediante un agente intercalante fluorescente.

5. Método según la reivindicación 4, en donde el agente intercalante es SYBR Green.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la detección del producto de amplificación se lleva a cabo mediante una sonda marcada.

7. Método según la reivindicación 6, en donde la sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en donde la sonda comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la amplificación se lleva a cabo en presencia de un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores que los usados para amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.

10. Método según la reivindicación 9, en donde el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago ?.

11. Método in vitro para la detección de Salmonella sp. en una muestra que comprende

12. Método según la reivindicación 11, en donde la amplificación se lleva a cabo en presencia de un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando la pareja de cebadores que comprende las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

13. Método según la reivindicación 12, en donde el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago ?.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde preparación de ácidos nucleicos comprende ADN genómico y/o ADNc obtenido a partir del ARN.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la muestra es se selecciona del grupo que comprende una muestra ambiental, una muestra clínica y una muestra alimentaria.

16. Un oligonucleótido cuya secuencia se selecciona del grupo de las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7.

17. Un kit que comprende una pareja de cebadores capaz de amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.

18. Kit según la reivindicación 17, en donde la pareja de cebadores comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3.

19. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18 que comprende, además, una sonda marcada capaz de detectar el producto de amplificación.

20. Kit según la reivindicación 19, en donde la sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher.

21. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, en donde la sonda comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4.

22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18 que comprende, además, un agente intercalante fluorescente.

23. Kit según la reivindicación 22, en donde el agente intercalante es SYBR Green.

24. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23 que comprende, además, un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores que los usados para amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.

25. Kit según la reivindicación 24, en donde el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago ?.

26. Un Kit que comprende (i) la pareja de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 y (ii) una sonda marcada, en donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7.

27. Kit según la reivindicación 26 que comprende, además, un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando la pareja de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6.

28. Kit según la reivindicación 27, en donde el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago ?.

29. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 28 para la detección de Salmonella sp. en una muestra.

30. Uso según la reivindicación 29, en donde la muestra se selecciona del grupo que comprende una muestra ambiental, una muestra clínica y una muestra alimentaria.