Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna.

Virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno deun retrovirus determinado,

siendo dicho MV recombinante el producto de la expresión de una secuencia denucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARNantigenómico (+) de longitud completa de un MV que se origina de la cepa Schwarz, en el que dicha molécula deADNc está recombinada con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidosheteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado y provocando dicho MV recombinante una respuestainmunitaria humoral y/o celular contra el MV o contra dicho retrovirus o contra los ambos, el MV y dicho retrovirus, yen el que dicha molécula de ADNc comprende la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 alnucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 11.

Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna [0001] La invención se refiere a virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de retrovirus y a su uso para la preparación de composiciones de vacuna.

El virus del sarampión es un miembro del orden mononegavirales, es decir, virus con un genoma ARN de cadena negativa no segmentado. El genoma no segmentado del virus del sarampión (MV del inglés "measles virus") tiene una polaridad antimensaje que produce un ARN genómico que no se traduce in vivo o in vitro ni es infeccioso cuando se purifica.

Se ha estudiado la transcripción y replicación de virus ARN de cadena (-) no segmentada y su ensamblaje como partículas virales y se ha presentado especialmente en Fields virology (3ª edición, vol. 1, 1996, Lippincott -Raven publishers - Fields BN et al.) . La transcripción y replicación del virus del sarampión no implican el núcleo de las células infectadas sino que en cambio tiene lugar en el citoplasma de dichas células infectadas. El genoma del virus del sarampión comprende genes que codifican seis proteínas estructurales principales a partir de los seis genes (denominados N, P, M, F, H y L) y dos proteínas no estructurales adicionales a partir del gen P. El orden de los genes es el siguiente: 3'-I, N, P (incluyendo C y V) , M, F, H, y la proteína polimerasa grande L en el extremo 5'. El genoma comprende adicionalmente regiones no codificantes en la región intergénica IWF; esta región no codificante contiene aproximadamente 1000 nucleótidos de ARN no traducido. Los genes citados codifican respectivamente el péptido líder (gen I) , las proteínas de la nucleocápsida del virus, es decir, la nucleoproteína (N) , la fosfoproteína (P) , y la proteína grande (L) que se ensamblan alrededor del ARN genómico para proporcionar la nucleocápsida. Los otros genes codifican las proteínas de la envuelta viral incluyendo las proteínas hemaglutinina (H) , de fusión (F) y de matriz (M) .

Se ha aislado el virus del sarampión y se han obtenido vacunas vivas atenuadas del aislado del MV Edmonston en 1954 (Enders, J. F., y T. C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures od cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286.) , por pases en serie en células renales o amnióticas humanas primarias. Las cepas usadas después se adaptaron para fibroblastos embrionarios de pollo (FEP) para producir semillas Edmonston A y B (Griffin, D., y W. Bellini. 1996. Measles virus, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.) , Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Filadelfia) . Edmonston B se autorizó en 1963 como la primera vacuna contra el MV. Pases adicionales de Edmonston A y B en FEP produjeron los virus Schwarz y Moraten más atenuados (Griffin, D., y W. Bellini. 1996. Measles virus, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.) , Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Filadelfia) cuyas secuencias se ha demostrado recientemente que son idénticas (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921-933; Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920) . Como la vacuna Edmonston B era reactogénica, se abandonó en 1975 y se remplazó por la vacuna Schwarz/Moraten que es actualmente la vacuna contra el sarampión más ampliamente usada en el mundo (Hilleman, M. 2002. Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications. Vaccine. 20: 651-665) . También se usan otras varias cepas de vacuna: AIK-C, Schwarz F88, CAM70, TD97 en Japón, Leningrad-16 en Rusia, y Edmonston Zagreb. Las cepas chinas CAM70 y TD97 no se obtuvieron de Edmonston. Las vacunas Schwarz/Moraten y AIK-C se producen en FEP. La vacuna Zagreb se produce en células diploides humanas (WI38) .

La vacuna viva atenuada obtenida de la cepa Schwarz está comercializada por Aventis Pasteur (Lyon Francia) con el nombre comercial Rouvax®.

En un trabajo notable y pionero, Martin Billeter y sus colegas clonaron el ADNc infeccioso correspondiente al antigenoma del MV Edmonston y establecieron un procedimiento genético original y eficaz para recuperar el virus correspondiente (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dötsch, G. Christiansen, y M. Billeter., 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal. 14:5773-5784) y documento WO 97/06270. Desarrollaron un vector Edmonston para la expresión de genes extraños (Radecke, F., y M. Billeter. 1997. Reverse genetics meets the nonsegmented negative-strand RNA viruses. Reviews in Medical Virology. 7:49-63.) y demostraron su gran capacidad de inserción (hasta 5 kb) y su alta estabilidad en la expresión de transgenes (Singh, M., y M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing biologically active human interleukin-12. J. Gen.Virol. 80:101-106; Singh, M., R. Cattaneo, y M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing hepatitis B virus surface antigen induces humoral immune responses in genetically modified mice. J. Virol. 73:4823-4828; Spielhofer, P., T. Bachi, T. Fehr, G. Christiansen, R. Cattaneo, K. Kaelin, M. Billeter, y H. Nairn. 1998. Chimeric measles viruses with a foreign envelope. J. Virol. 72:2150-2159) ; Wang, Z., T. Hangartner, L. Cornu, A. Martin, M. Zuniga, M. Billeter, y H. Nairn. 2001. Recombinant measles viruses expressing heterologus antigens of mumps and simian immunodeficiency viruses. Vaccine. 19:2329-2336. Este vector se clonó a partir de la cepa Edmonston B del MV propagado en células HeLa (Ballart, I., D. Eschle, R. Cattaneo, A. Schmid, M. Metzler, J. Chan, S. Pifko-Hirst, S. A.

Udem, y M. A. Billeter. 1990. Infectious measles virus from cloned cDNA. Embo J. 9:379-384) . [0007] Además, se ha producido virus recombinante del sarampión que expresa el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y ha demostrado inducir respuestas inmunitarias humorales en ratones genéticamente modificados (Singh M. R. et al., 1999, J. virol. 73: 4823-4828) .

A partir de la observación de que las propiedades del virus del sarampión, y específicamente su capacidad para provocar altas titulaciones de anticuerpos neutralizantes in vivo y su propiedad de ser un fuerte inductor de respuesta inmunitaria celular permanente, los inventores han propuesto que puede ser un buen candidato para la preparación de composiciones que comprenden virus infecciosos recombinantes que expresan péptidos o polipéptidos antigénicos de retrovirus, para inducir anticuerpos neutralizantes contra dichos retrovirus que pueden ser preferentemente adecuados para conseguir al menos algún grado de protección contra dichos retrovirus, en animales y más preferentemente en hospedadores humanos. Entre los retrovirus de interés, los inventores han seleccionado los retrovirus del SIDA, incluyendo el HIV-1.

Entre los flavivirus, el Virus de la Fiebre Amarilla (YFV) y el Virus del Nilo Occidental (WNV) son importantes patógenos humanos.

El YFV y el WNV pertenecen a la familia Flaviviridae descrita en Fields virology (3ª edición, vol. 1, 1996, Lippincott - Raven publishers - Fields BN et al.) .

Por tanto, la invención proporciona virus recombinantes del sarampión que pueden expresar antígenos y especialmente epítopos derivados de antígenos de retrovirus. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, especialmente a construcciones de ácido nucleico que expresan el virus recombinante del sarampión y que con el mismo expresan antígenos o epítopos de antígenos de retrovirus.

La invención también se refiere a procedimientos para la preparación de dichos virus recombinantes del sarampión y especialmente se refiere a la producción de dicho MV recombinante en sistemas de recuperación.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden dichos virus recombinantes del sarampión como principios activos para la protección de hospedadores, especialmente hospedadores humanos, contra enfermedades relacionadas con infecciones ocasionadas por dichos retrovirus, especialmente por retrovirus del SIDA.

La solicitud también describe virus recombinantes del sarampión capaces de expresar antígenos y especialmente epítopos derivados de antígenos de virus de ARN incluyendo flavivirus.

La solicitud también describe construcciones de ácido nucleico recombinante que expresan los virus recombinantes... [Seguir leyendo]

1. Virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado, siendo dicho MV recombinante el producto de la expresión de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un MV que se origina de la cepa Schwarz, en el que dicha molécula de ADNc está recombinada con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado y provocando dicho MV recombinante una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra el MV o contra dicho retrovirus o contra los ambos, el MV y dicho retrovirus, y en el que dicha molécula de ADNc comprende la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 11.

2. Virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado, siendo dicho MV recombinante el producto de la expresión de una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una molécula de ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa de un MV que se origina de la cepa Schwarz, en el que dicha molécula de ADNc está recombinada con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga de un antígeno de un retrovirus determinado y provocando dicho MV recombinante una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra el MV o contra dicho retrovirus o contra ambos, el MV y dicho retrovirus, y en el que dicha molécula de ADNc comprende el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado el 12 de junio del 2002 con el Nº I-2889, en el que dicho inserto codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV.

3. MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que se recupera de células auxiliares transfectadas con una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende ADNc que codifica la secuencia de nucleótidos del ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV, estando dicho ADNc recombinado con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga retroviral, y cumpliendo dicha secuencia de nucleótidos recombinante la regla de seis.

4. Virus recombinante del sarampión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula de ADNc se selecciona entre las siguientes secuencias:

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15977 de la figura 11;

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 al nucleótido 15977 de la figura 11;

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 29 al nucleótido 16202 de la figura 11;

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 al nucleótido 15977 de la figura 11;

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 26 al nucleótido 16202 de la figura 11;

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 al nucleótido 15977 de la figura 11; y

- secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 9 al nucleótido 16202 de la figura 11.

5. MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga es de un antígeno de envuelta del retrovirus del HIV.

6. MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga es un antígeno gp160 recombinante o de gp120 recombinante del HIV-1.

7. MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 están delecionados, o delecionados en parte, individualmente o en combinación, de tal manera que los epítopos conservados están expuestos sobre el antígeno gp120 recombinante obtenido.

8. MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en el que los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 están sustituidos, o sustituidos en parte, individualmente o en combinación, de tal manera que los epítopos conservados están expuestos sobre el antígeno gp120 recombinante obtenido.

9. MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el bucle V3 está sustituido por un epítopo gp41 tal como AAELDKWASAA.

10. MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga se selecciona entre:

- un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA (gp160ΔV3) ,

- un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados (gp160ΔV1V2) ,

- un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados y en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA (gp160ΔV1V2V3) ,

- un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA (gp140ΔV3) ,

- un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados (gp140ΔV1V2) y

- un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados y en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA (gp140ΔV1V2V3) .

11. MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que provoca una respuesta inmunitaria humoral y/o celular en un modelo animal susceptible al MV.

12. MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia de aminoácidos heteróloga en un modelo animal de mamífero susceptible al MV.

13. MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la secuencia de aminoácidos heteróloga es de una proteína de envuelta del HIV-1 y que provoca anticuerpos capaces de neutralizar un aislado primario del HIV cuando se somete a ensayo en células indicadoras tales como células P4-CCR5.

14. MV recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, que provoca anticuerpos neutralizantes contra la secuencia de aminoácidos heteróloga en un mamífero, con un título de al menos 1/40 000 cuando se mide en un ELISA.

15. Vector del virus recombinante del sarampión (MV) que comprende un replicón que comprende (i) una secuencia de ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa de un MV unida operativamente a (ii) secuencias de control de expresión y (iii) una secuencia de ADN heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos heteróloga determinada de un retrovirus, estando dicha secuencia de ADN heteróloga clonada en dicho replicón en condiciones que permitan su expresión y teniendo dicho replicón un número total de nucleótidos que cumple con la regla de seis, en el que la secuencia de nucleótidos que comprende el ADNc resultante de la transcripción inversa del ARN antigénico del MV es una molécula de ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 11

o que comprende el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado el 12 de junio del 2002 con el Nº I2889, en el que dicho inserto codifica la secuencia de nucleótidos de la cadena de ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV.

16. Vector del MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la secuencia de ADN heteróloga está clonada dentro de una Unidad de Transcripción Adicional (ATU) insertada en el ADNc correspondiente al ARN antigenómico del MV.

17. Vector del MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sitio de clonación de la ATU se selecciona corriente arriba desde el gen N del MV.

18. Vector del MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sitio de clonación de la ATU se selecciona entre los genes P y M del MV.

19. Vector de MV recombinante de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el sitio de clonación de la ATU está entre los genes H y L del MV.

20. Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que la secuencia de ADN heteróloga se expresa como una proteína de fusión con una de las proteínas del MV.

21. Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que la secuencia de ADN heteróloga no se expresa como una proteína de fusión con una de las proteínas del MV.

22. Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, en el que la secuencia de ADN heteróloga codifica una secuencia de aminoácidos retroviral de un antígeno de un retrovirus seleccionado entre el retrovirus del HIV.

23. Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en el que la secuencia de ADN heteróloga codifica una secuencia de aminoácidos retroviral de un antígeno de envuelta de un retrovirus del HIV.

24. Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, en el que la secuencia de ADN heteróloga codifica una secuencia de aminoácido retroviral seleccionada entre la gp160, la gp120 o la gp41 del HIV-1, o la gp140 del HIV-1.

25. Vector de MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25, en el que la secuencia de ADN heteróloga codifica:

- un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA (gp160ΔV3) ,

- un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados (gp160ΔV1V2) ,

- un antígeno gp160 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados y en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA (gp160ΔV1V2V3) ,

- un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA (gp140ΔV3) ,

- un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados 10 (gp140ΔV1V2) y

- un antígeno gp140 recombinante del HIV-1, en el que los bucles V1 y V2 de gp120 están delecionados y en el que el bucle V3 de gp120 está sustituido por el epítopo AAELDKWASAA (gp140ΔV1V2V3) ,

26. Vector del MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 26, en el que el ADNc que codifica el ARN antigenómico (+) de longitud completa del MV y la secuencia de control de expresión son del pTM-MVSchw depositado en el CNCM con el Nº I-2889.

27. Vector del MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 27, que es un plásmido.

28. Un sistema de recuperación para el conjunto del virus recombinante del sarampión (MV) que expresa una secuencia de aminoácidos heteróloga, que comprende una célula determinada transfectada con un vector del MV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 28, y una célula auxiliar determinada recombinada con al menos un vector adecuado para la expresión de la ARN polimerasa T7 y la expresión de las proteínas N, P y L del MV.