Procedimiento para la producción de daptomicina mediante fermentación de Streptomyces roseosporus en presencia de n-decanal o aceite de Cuphea como fuentes de la cadena lateral de n-decanoílo

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para la producción de daptomicina mediante fermentación con Streptomyces roseosporus, usando fuentes alternativas de la cadena lateral de n-decanoílo.

10 Antecedentes de la invención

A-21978C10, conocido como daptomicina, es un antibiótico peptídico cíclico de 13 aminoácidos de fórmula (I)

**(Ver fórmula)**

que contiene una cadena lateral de n-decanoílo unida al triptófano N-terminal.

La daptomicina se produce mediante fermentación sumergida de Streptomyces roseosporus, en particular cepas NRRL 11379 (ATCC 31568) y NRRL 15998, así como cualquier mutante, variante y recombinante de las mismas.

La producción de daptomicina en cultivo sumergido se dio a conocer por primera vez en los documentos US

4.331.594 y US 4.800.157.

El documento US 4.885.243 da a conocer la preparación de daptomicina mediante fermentación discontinua alimentada, en la que se alimenta ácido decanóico, usado como fuente de la cadena lateral de n-decanoílo, como una disolución en un disolvente orgánico, concretamente oleato de metilo. La presencia del disolvente en la disolución de alimentación es necesaria, porque el ácido decanóico es un sólido ceroso a la temperatura de fermentación y sólo disoluciones que contienen al menos el 50% de disolvente son suficientemente fluidas para alimentarse. No obstante, incluso en presencia de un disolvente, a temperaturas inferiores a 25ºC es difícil mantener una alimentación constante y homogénea, porque el ácido decanóico puede separarse de la disolución o formar copos y flóculos. El ácido decanóico ejerce un efecto tóxico sobre la bacteria y por este motivo la velocidad de alimentación debe mantenerse bajo control estricto.

Descripción de la invención

35 Se ha encontrado ahora que los inconvenientes mencionados anteriormente pueden superarse usando fuentes alternativas de la cadena lateral de n-decanoílo, concretamente decanal (n-decaldehído, caprinaldehído, aldehído cáprico) o aceite de Cuphea. Por consiguiente, en una primera realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de daptomicina mediante fermentación de Streptomyces roseosporus en

40 presencia de n-decanal; en una segunda realización la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de daptomicina mediante fermentación de Streptomyces roseosporus en presencia de aceite de Cuphea. Cepas de Streptomyces roseosporus particularmente adecuadas para llevar a cabo el procedimiento son NRRL 11379 (ATTC 31568), NRRL 15998 y mutante B8.

45 En la primera realización, puede alimentarse n-decanal o bien como una disolución orgánica en un disolvente orgánico adecuado, tal como oleato de metilo, etanol, acetato de etilo, preferiblemente oleato de metilo, o bien sin disolventes, debido a que el n-decanal es líquido a temperatura ambiente y no se produce la separación de copos o formación de flóculos.

50 De hecho, S. roseosporus puede convertir enzimáticamente el aldehído en ácido, que entonces se une al Ntriptófano terminal; se señala que esta conversión no se produce con fuentes de C10 diferentes, por ejemplo decanol. El uso de n-decanal permite aumentar la productividad del 10% al 30% con respecto al 50% de ácido

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decanóico + el 50% de oleato de metilo, probablemente debido al hecho de que este aldehído es líquido, de modo que se dispersa en el caldo de fermentación y está más biodisponible. Además, n-decanal es menos toxico que el ácido n-decanóico: de hecho, en el microscopio, los micelios aparecen menos fragmentados o vacuolizados y esta toxicidad reducida permite mantener una velocidad de producción satisfactoria durante un periodo más largo.

En la segunda realización, se usa aceite de Cuphea, o bien como tal o bien disuelto en un disolvente orgánico o mezclado con otro aceite vegetal. El aceite de Cuphea adecuado para llevar a cabo la invención puede derivarse de las semillas de varias especies de Cuphea, tales como C. lanceolata, C. viscosissima y C. koehneana o especies híbridas obtenidas de las mismas. Los disolventes orgánicos adecuados son, por ejemplo, oleato de metilo, etanol, acetato de etilo, preferiblemente oleato de metilo; aceites vegetales adecuados son, por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de palma; sin embargo, ya que el aceite de Cuphea es fluido a temperatura ambiente, se alimenta preferiblemente como tal. El aceite de Cuphea contiene triglicéridos con ácidos grasos de diferentes longitudes que se hidrolizan por el microorganismo y se usan para la síntesis de daptomicina. Se encontró sorprendentemente que el aceite de Cuphea tiene una toxicidad tan baja sobre el microorganismo que se tolera su acumulación en la fermentación; por tanto, a diferencia de ácido decanóico/oleato de metilo, no es necesario el control estricto de la velocidad de alimentación y el procedimiento puede llevarse a cabo de manera discontinua, es decir introduciendo todo el sustrato en el comienzo de la fermentación; esto significa que no se requiere un tanque de alimentación, un dispositivo de alimentación y controles durante la adición.

En el procedimiento de la invención, también puede alimentarse una fuente de carbono necesaria para el metabolismo primario del microorganismo, como glicerol, junto con n-decanal o aceite de Cuphea, alcanzando así un mejor equilibrio entre el crecimiento del microorganismo y la producción de daptomicina.

A partir de lo anterior parece que el procedimiento de la invención es ventajoso a escala industrial, ya que es más conveniente de llevar a cabo y más barato, principalmente debido al hecho de que puede evitarse el uso de disolventes y que las fuentes de carbono tienen una toxicidad limitada sobre el microorganismo. El uso de n-decanal puro es particularmente ventajoso porque el microorganismo se alimenta con un 100% de fuente de C10.

La invención se ilustrará en mayor detalle por medio de los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 - Decanal + oleato de metilo

1A: NRRL11379 de Streptomyces roseosporus en un fermentador de 20 l

Se almacenó un cultivo madre de Streptomyces roseosporus bajo nitrógeno, entonces se usó para inocular una primera fase de fermentación vegetativa. Se incubó el medio sembrado, cuya composición se notifica en las tablas 1 y 2, en un matraz de fondo redondo de 2 l, que contenía 450 ml de caldo, a 30ºC durante 40 h sobre un agitador giratorio con una velocidad de agitación de 150 rpm.

Tabla 1: Medio

COMPONENTE 1 l Dextrosa 20 g Harina de soja 20 g Extracto de levadura 1 g KH2PO4 0,22 g CaCO3 2 g Solución salina 2 ml Sin ajuste de pH Esterilización 121ºC x 20 min.

Tabla 2: Solución salina

COMPONENTE 100 ml FeSO4 0,2 g HCl (37%) 2 ml MgSO4•7H2O 10 g KCl 10 g Esterilización 121ºC x 20 min.

Al final de la incubación, se usó la fase crecida para sembrar un fermentador de producción (capacidad de 20 l, volumen de trabajo de 15 l) que contenía un medio que tenía la siguiente composición (tabla 3).

Tabla 3: Medio de producción

COMPONENTE g/l Harina de soja 22 Fe(NH4)2SO4 0,66 pH ajustado a 7,0 KH2PO4 (opcional) 0,22 Dextrosa 8,25 Dextrina de patata 33 Melazas 2,75 Voranol 0,8 Esterilización 121ºC x 45 min.

5 Se llevó a cabo la incubación de la fase de producción en las siguientes condiciones: 30ºC, 1 vvm, agitación de 150÷350 rpm y contrapresión de 0,5 bar. Se mantuvo el pH a 6,5 mediante adición de una disolución de hidróxido de amonio.

Tras 18 h, cuando la concentración en glucosa del medio disminuyó por debajo de 3-4 g/l, se alimentó el fermentador con una disolución que contenía el 50% de decanal y el 50% de oleato de metilo (v/v) a una velocidad de flujo que oscilaba desde 3 hasta 7 ml/h.

La producción de daptomicina empezó tras 40 h y alcanzó una productividad de 0,6 g/l en 186 h. 1B: NRRL11379 de Streptomyces roseosporus en un fermentador de 1000 l

Se almacenó Streptomyces roseosporus bajo nitrógeno. Entonces se usó el cultivo madre para inocular la primera fase de fermentación vegetativa. Se incubó el medio sembrado previamente, cuya composición se notifica en la tabla 4, en un matraz de fondo redondo de dos (2 l), que contenía 450 ml de caldo, a 30ºC durante 40 h en un agitador giratorio con una... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de daptomicina mediante fermentación de Streptomyces roseosporus en presencia de n-decanal o aceite de Cuphea como fuentes de la cadena lateral de n-decanoílo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fuente de la cadena lateral de n-decanoílo es ndecanal.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que se alimenta n-decanal como una disolución en un disolvente orgánico seleccionado de oleato de metilo, etanol y acetato de etilo.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el disolvente es oleato de metilo.

5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que se alimenta n-decanal sin disolventes.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fuente de la cadena lateral de n-decanoílo es aceite de Cuphea.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que se alimenta aceite de Cuphea como una disolución en un disolvente orgánico seleccionado de oleato de metilo, etanol o se mezcla con aceite de soja, aceite de palma o aceite de girasol.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el disolvente orgánico es oleato de metilo.

9. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que se alimenta aceite de Cuphea sin disolventes.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 6 - 9 que se lleva a cabo como fermentación discontinua con aceite de Cuphea puro.