Procedimiento para la detección de adulteraciones en aceites de oliva con aceites de semilla (soja y girasol) basado en la determinación de trigonellina por Electroforesis Capilar.

El objetivo de la invención es el desarrollo de un procedimiento analítico por Electroforesis Capilar con detección UV que permita determinar el aminoácido no proteico trigonellina en semillas (girasol y soja) y en sus aceites e investigar su presencia en aceitunas y aceites de oliva. La presencia de este aminoácido en las semillas de girasol y soja y en sus aceites permite establecer una relación de trazabilidad aceite-semilla. La ausencia de trigonellina en aceituna (Picual, Hojiblanca y Arbequina) y sus aceites permite proponer este aminoácido como marcador novedoso para la detección de adulteraciones de aceites de oliva virgen con aceites de semilla (girasol y soja).

La invención consiste en la separación electroforética de trigonellina del resto de componentes de las muestras utilizando un medio ácido como el tampón formiato amónico a pH 2.0 y una detección UV directa a 195 nm.

Procedimiento para la detección de adulteraciones en aceites de oliva con aceites de semilla (soja y girasol) basado en la determinación de trigonellina por Electroforesis Capilar.

El procedimiento analítico propuesto permite la identificación y la cuantificación de trigonellina en semillas (girasol y soja) y sus aceites empleando la técnica de Electroforesis Capilar (CZE) con detección UV. Este procedimiento también permite establecer la ausencia de trigonellina en aceituna (Picual, Hojiblanca y Arbequina) y aceites de oliva virgen (Picual, Hojiblanca y Arbequina) . Teniendo en cuenta que la mezcla de aceites de oliva con aceites de semillas no está permitida por la legislación vigente, este procedimiento supone un gran avance por la posibilidad de emplear un solo compuesto, trigonellina, como marcador de posibles adulteraciones de aceite de oliva con aceites de semillas (girasol y soja) con el fin de evaluar la calidad de los aceites de oliva, así como para evitar fraudes económicos. Asimismo, permite evaluar la seguridad por la potencial presencia de algunos alérgenos en otros aceites vegetales (p. ej. soja) .

Estado de la técnica El aceite de oliva es conocido, valorado y producido principalmente en la cuenca Mediterránea desde tiempos remotos y se extrae de los frutos de aceitunas que crecen en los olivos Olea europea L. [1]. Hoy en día, en el mercado se pueden distinguir numerosos tipos de aceites de oliva: aceites de oliva virgen que se clasifican según su grado de acidez y se obtienen mediante un tratamiento físico (prensado o centrifugación) que permite separar el aceite de la aceituna triturada, aceites refinados (de oliva o de orujo) que se obtienen mediante un proceso químico (extracción con disolventes) y el aceite de oliva que se obtiene al mezclar aceite de oliva virgen con aceite de oliva refinado [2, 3]. El aceite de oliva más apreciado y de mayor precio en el mercado es el aceite de oliva virgen extra.

La importancia de los aceites de oliva, y en particular el aceite de oliva virgen extra, se ha puesto de manifiesto en numerosas publicaciones, donde el consumo de este producto se ha relacionado con beneficios para la salud humana. Así, se ha publicado que el aceite de oliva contribuye a reducir el colesterol en plasma [4, 5] y tiene propiedades antioxidantes [1] además de otros beneficios más generales [6]. También se ha investigado su acción protectora frente al cáncer de mama [7-10], al carcinoma colorectal [11] o a enfermedades cardiovasculares [12, 13].

Debido a que el aceite de oliva virgen extra es uno de los aceites más caros de origen vegetal, ha sido objeto de adulteraciones para incrementar los beneficios económicos de los fabricantes. El método más común de adulteración consiste en añadir al aceite de oliva aceites más baratos. Entre ellos, los más comunes son los aceites de girasol o soja. Además, la adulteración del aceite de oliva con aceites de semilla afecta la seguridad alimentaria porque existen aceites de materias primas, como p. ej. la soja, que tienen un conocido potencial alergénico y pueden afectar a la salud del consumidor si se añade fraudulentamente. De hecho, en la normativa vigente se prohíbe concretamente la mezcla de aceite de oliva con los de semillas o con cualquier otro aceite o grasa [14]. Por ello, es necesario desarrollar aproximaciones analíticas que permitan determinar la posible adulteración de los aceites de oliva con aceites de semillas.

El aceite de oliva tiene una composición compleja porque contiene numerosos constituyentes de diversa naturaleza. A grandes rasgos, la composición del aceite de oliva virgen se puede dividir en dos fracciones: (i) una fracción saponificable que forma la mayor parte del aceite, entre el 98.5 y el 99.5%, compuesta por triglicéridos, ácidos grasos, ceras y fosfolípidos y (ii) una fracción no saponificable que solo representa entre el 0.5 y el 1.5% del aceite. Esta última fracción está compuesta por hidrocarburos, tocoferoles, alcoholes grasos, esteroles, compuestos fenólicos, pigmentos y compuestos volátiles y aromáticos. La autenticidad de los aceites de oliva se ha estudiado mediante técnicas cromatográficas determinando ácidos grasos, triglicéridos, esteroles, tocoferoles y tocotrienoles [15]. Por otro lado, estudios recientes confirman que, entre los componentes minoritarios del aceite, existen péptidos y proteínas que se transfieren de las semillas o frutos al aceite [16, 17]. Además, hay un trabajo donde se estudian perfiles de aminoácidos proteicos para clasificar aceites vegetales según su origen botánico utilizando espectrometría de masas [18]. Sin embargo, aunque se ha confirmado la presencia de aminoácidos no proteicos libres en diversas semillas alimenticias [19-21], no existen antecedentes que estudien la presencia de éstos en los aceites obtenidos de estas semillas.

La trigonellina es un aminoácido no proteico con un grupo amino cuaternario que le proporciona una carga positiva permanente. La trigonellina también es una betaína. Las betaínas son osmorreguladores naturales de muchas plantas y están presentes en un gran número de alimentos. Además, las betaínas han sido objeto de estudio en varias investigaciones por sus efectos biológicos potencialmente positivos en humanos. La trigonellina se ha determinado en un amplio número de alimentos como frutas, cereales, verduras, bebidas, carne, marisco y productos lácteos mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) tras su derivatización con sulfonato de 2-naftilo trifluorometano [22, 23], En la gran mayoría de ellos, la trigonellina se encontró en concentraciones muy bajas (p.ej. chocolate) o no detectables (p.ej. aceite de oliva) , para un límite de detección de 1 μg/g, mientras que se encontraron concentraciones elevadas de trigonellina en granos de café, lentejas y garbanzos. Esto ha sido corroborado en otros artículos donde el contenido de trigonellina en la planta de lentejas fue determinado mediante HPLC tras su derivatización con fenilisotiocianato (PITC) [20, 24], En granos de café, donde se encuentra el mayor contenido en trigonellina, se ha determinado mediante HPLC [25-31], HPLC acoplada a Espectrometría de Masas (MS) [32], Cromatografía de Gases (GC) [33], GC-MS [34] y MS [35]. La trigonellina también se ha encontrado en cantidades considerables en semillas de soja tras su determinación espectrofotométrica en un espectrómetro UV [36] o mediante HPLC tras su derivatización con PITC [37].

El objetivo de esta invención es el desarrollo de un procedimiento por CE con detección UV que permita estudiar trigonellina, en semillas (girasol y soja) , frutos (aceitunas) y sus respectivos aceites, con el fin de proponer por primera vez este compuesto como marcador de adulteraciones de aceite de oliva con aceites de semillas.

Descripción de la invención El procedimiento para la determinación de trigonellina por CE se basa en un medio de separación ácido realizado en un equipo de electroforesis capilar HP3DCE equipado con un detector ultravioleta-visible (UV-Vis) de diodos en serie (DAD) .

TABLA 1

Resumen del procedimiento de determinación de trigonellina por CE

Determinación cuantitativa de trigonellina en semillas de girasol y soja y sus aceites El procedimiento se aplica a la cuantificación de trigonellina en semillas de soja, semillas de girasol, aceite de girasol y aceites de soja. Los resultados confirman la presencia de trigonellina tanto en las semillas de soja y girasol como en sus respectivos aceites. De esta forma se establece la trazabilidad de trigonellina desde la semilla hasta su aceite. En la Figura 1 se muestra el electroferograma correspondiente a las semillas de soja y girasol mientras que en la Figura 2 se muestran los perfiles electroforéticos obtenidos para los aceites de semillas estudiados (girasol refinado, soja refinado y virgen) . Se observa que el pico de trigonellina se encuentra separado del resto de componentes de la matriz por lo que el método es selectivo a la hora de identificar y cuantificar el analito de interés. Para la identificación de trigonellina se obtienen los espectros UV de los picos y se comparan con el espectro UV de trigonellina patrón. También se enriquece la muestra con una disolución patrón de concentración conocida para observar el aumento del pico asignado a trigonellina según su espectro UV.

Para la determinación de trigonellina se inyectan las muestras sin enriquecer y enriquecidas con cuatro niveles de calibrado, se realiza una recta de calibrado representando las áreas corregidas (Ac) del pico de trigonellina en función de la concentración añadida... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de determinación de trigonellina caracterizado porque permite estudiar este aminoácido no proteico en semillas (girasol y soja) , frutos (aceituna) y sus aceites por Electroforesis Capilar (CE) con detección UV sin necesidad de derivatización y empleando un medio ácido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque requiere diferente tratamiento de muestra, dependiendo de la muestra analizada: (i) extracción sólido-líquido para las semillas y frutos (aceituna) (10 g) y (ii) extracción líquido-líquido para los aceites (40 g) . En ambos casos se extrae con metanokcloroformo (67:33, v/v) , se agita vigorosamente y se deja una noche a -20º C. Después se centrifuga y el sobrenadante se recoge. El residuo se lava con metanol/cloroformo/agua (53:26:21, v/v/v) y se combina el nuevo sobrenadante con el recogido previamente. A este sobrenadante se le añade cloroformo y agua, se centrifuga y se recupera la fase acuosa que se lleva a evaporar hasta sequedad. El residuo se reconstituye en 300 μL de acetonitrilo/agua (40:60, v/v) .

3. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado por realizar la determinación de trigonellina mediante CE en un capilar de sílice fundida no recubierto de 50 μm de diámetro interno y 375 μm de diámetro externo con una longitud total de 75 cm que debe acondicionarse previamente a la inyección de los patrones y muestras con el tampón de separación (1 bar) durante 2 min.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado por el empleo de un medio de separación acuoso para CE con fórmico 0.1 M ajustado a pH 2.0 con hidróxido amónico al 25%.

5. Procedimiento según las reivindicaciones3y4 caracterizado por los siguientes parámetros instrumentales en CE: inyección por presión de 50 mbar durante 15 s de las muestras de semillas (girasol y soja) y 50 mbar durante 50 s para las muestras de aceituna y los aceites de semilla (girasol y soja) y de oliva virgen extra; temperatura de 35º C y voltaje de separación de 25 kV.

6. Procedimiento según la reivindicación 5 caracterizado por el empleo de una estrategia de preconcentración (stacking) en el capilar para mejorar la sensibilidad y selectividad de detección en el caso de los aceites y aceituna.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la detección se realiza a 195 nm mediante un detector de diodos en serie (DAD) .

8. Procedimiento según la reivindicación 7 caracterizado porque la identificación del pico de trigonellina en las muestras se realiza según su espectro UV, el cual presenta dos máximos de absorción característicos a 214 y 260 nm.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 2, 5 y 8 caracterizado porque permite la identificación y determinación cuantitativa de trigonellina en semillas de girasol y soja y sus aceites.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 2, 5 y 8 caracterizado porque establece la ausencia de trigonellina en aceitunas (Picual, Hojiblanca y Arbequina) y sus aceites.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 9 y 10 caracterizado por la propuesta de trigonellina como marcador novedoso de adulteraciones de aceite de oliva con aceites de semillas (girasol y soja) .

ES 2 363 585 Bl

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 201000098

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 28.01.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : G01N27/26 (01.01.2006)

DOCUMENTOS RELEVANTES

18. 194. Página 189. 1-11 1-11 A CASTRO-PUYANA, MARÍA et al. CE methods for the determination of non-protein amino acids in foods. Electrophoresis 2007. Vol. 28 páginas 4031-4045. Página 4034. A NISHIMURA, NAOKI et al. Application of capillar y electrophoresis to the simultaneous determination of betaines in plants. Analytical Sciences 2001. Vol. 17 página.

10. 106. 1-11 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 10.03.2011 Examinador I. Rueda Molíns Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201000098

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, TXT

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201000098

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 10.03.2011

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201000098

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

18. 194. 2002 D02 CASTRO-PUYANA, MARÍA et al. CE methods for the determination of non-protein amino acids in foods. Electrophoresis. Vol. 28 páginas 4031-4045. 2007 D03 NISHIMURA, NAOKI et al. Application of capillar y electrophoresis to the simultaneous determination of betaines in plants. Analytical Sciences. Vol. 17 página.

10. 106. 2001

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La solicitud de patente divulga un procedimiento para la detección de adulteraciones en aceites de oliva con aceites de semilla basado en la determinación de trigonellina por electroforesis capilar.

Los documentos D01, D02 y D03 muestran la determinación de aminoácidos no proteicos mediante electroforesis capilar.

NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Artículos 6 y 8 LP11/1986)

En las reivindicaciones 1-11 de la solicitud de patente se reivindica un procedimiento de determinación de trigonellina en semillas, frutos y sus aceites por electroforesis capilar con detección UV, sin necesidad de derivatización y empleando un medio ácido.

Los documentos D01 y D02, que son los que reflejan el estado de la técnica más cercano, muestran (en la página 189 el documento D01 y en la página 4034 el documento D02) un método para la determinación de trigonellina mediante electroforesis capilar con detección UV empleando un paso de derivatización. Por tanto, las reivindicaciones 1-11 presentan novedad y actividad inventiva según lo establecido en el Artículos 6 y 8 de la Ley 11/1986.

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