Métodos para transferir sustancias moleculares al interior de células vegetales.

Un método para introducir una molécula de interés en una célula vegetal que tiene pared celular,

que comprende:

i) sub-cultivar un cultivo en suspensión vegetal de una semana de antigüedad que comprende una célula vegetal que tiene pared celular en un medio de cultivo reciente que contiene una cantidad eficaz de un inhibidor de microtubulina durante 4 a 7 días, con lo que se produce un subcultivo vegetal que comprende la célula vegetal que tiene una pared celular;

ii) revestir una nanopartícula que tiene un diámetro menor que 100 nm con una molécula de interés;

iii) poner el subcultivo vegetal y la nanopartícula revestida en contacto entre sí; y

iv) incubar conjuntamente el subcultivo vegetal y la nanopartícula revestida durante al menos 20 minutos, para permitir la captación de la nanopartícula y la molécula de interés en la célula vegetal que comprende una pared celular.

Métodos para transferir sustancias moleculares al interior de células vegetales.

Antecedentes Las nanopartículas tienen propiedades únicas que han sido aprovechadas para su uso en el suministro de ADN a las células. Entre todas las nanopartículas investigadas, las nanopartículas de oro (Au) tienden a ser excelentes candidatos para el suministro debido a su escasa citotoxicidad y facilidad de funcionalización con varios ligandos de importancia biológica. La síntesis comunmente utilizada de nanopartículas de Au proporciona una superficie cargada negativamente (por ej., revestimiento de citrato) . El ADN plasmídico, que puede ser suficientemente flexible para desenrollar parcialmente sus bases, puede ser expuesto a nanopartículas de oro ("GNPs, por sus siglas en inglés") . En estas condiciones parcialmente desenrolladas, la carga negativa en la cadena del ADN puede estar suficientemente distante como para permitir que las fuerzas de atracción de Van der Waals entre las bases y la nanopartícula de oro sean suficientes para hacer que el ADN plasmídico se una a la superficie de la partícula de oro.

Además de nanopartículas metálicas, también se han usado nopartículas semi-conductoras (por ej., puntos cuánticos) ("QD", por sus siglas en inglés) dentro del intervalo de tamaños de 3-5 nm como vehículos para suministrar las moléculas al interior de las células. El ADN y las proteínas se pueden enlazar al ligando fijado a la superficie de un QD (véase, por ej., Patolsky, F. et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003) ) . Los QDs revestidos con ácidos carboxílicos o aminas se pueden entrecruzar con moléculas que contienen un grupo tiol (véase, p.ej., Dubertret B. et al., Science 298, 1759 (2002) ; Alterman, M. E., W. C. W. Chan, P. Laakkonen, S. N. Bhatia, E. Ruoslahti, Proc. Natl. Acad, Sci. U.SA. 99, 12617 (2002) ; Mitchell, G. P., C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc. 121, 8122 (1999) ) o con un grupo éster N-hidroxisuccinimilo (NHS) usando protocolos clásicos de bioconjugación (véase, p.ej., Pinaud, F. , D. King, H. P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004) ; Bruchez, M. Moronne, P. Gin, S. Weiss, A. P. Alivisatos, Science 281, 2013 (1998) ) . Una vía alternativa es la conjugación de QDs revestidos con estreptavidina a proteínas, oligos o anticuerpos biotinilados (véase, p.ej., Dahan M. et al., Science 302, 442 (2003) ; Pinaud, F., D. King, H. P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004) ; Dahan M. et al., Science 302, 442 (2003) ; Wu, X. Y., et al., Nature Biotechnol, 21, 41 (2003) ; Jaiswal, J. K., H. Mattoussi, J. M. Mauro, S. M. Simon, Nature Biotechnol. 21, 47 (2003) ; y Mansson, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 314, 529 (2004) .

Se han usado nanopartículas para suministrar ADN plasmídico a diversidad de células animales. Se ha encontrado que cuando nanopartículas revestidas con ADN se incuban con células que no tienen pared celular, las células captan las nanopartículas y empiezan a expresar cualquier gen codificado en el ADN. Cuando se desea suministrar nanopartículas a células que normalmente tienen pared celular, ésta se separa antes de la adición de las partículas a los protoplastos de la planta (véase, Torney, F. et al., Nature Nanotechnol. 2, (2007) ) . En las células vegetales, la pared celular es una barrera para la entrega de moléculas aplicadas exógenamente. Muchos métodos invasivos, como el cañón de genes (biolística) , la microinyección, la electroporación, y Agrobacterium, han sido empleados para lograr el suministro de genes y moléculas pequeñas a estas células vegetales con paredes, pero la administración de proteínas sólo se ha logrado mediante microinyección.El suministro de moléculas pequeñas y proteínas en presencia de una pared celular de una célula vegetal permanece inexplorado y sería ventajoso con el fin de desarrollar tecnologías de apoyo para su despliegue en células, tejidos u órganos vegetales intactos para manipulaciones in vitro e in vivo.

La presente invención se refiere a métodos que usan nanopartículas para suministrar de forma no invasiva sustancias moleculares a las células que tienen una pared celular.

Descripción de la invención Se proporciona un método para introducir una molécula de interes en una célula vegetal que tiene pared celular, que comprende:

i) subcultivar un cultivo en suspensión vegetal de una semana de antigüedad que comprende una célula vegetal que tiene pared celular en un medio de cultivo reciente que contiene una cantidad eficaz de un inhibidor de microtubulina durante 4 a 7 días, con lo que se produce un subcultivo vegetal que comprende la célula vegetal que tiene una pared celular;

ii) revestir una nanopartícula que tiene un diámetro menor que 100 nm con una molécula de interés;

iii) poner el subcultivo vegetal y la nanopartícula revestida en contacto entre sí; y iv) incubar conjuntamente el subcultivo vegetal y la nanopartícula revestida durante al menos 20 minutos, para permitir la captación de la nanopartícula y la molécula de interés en la célula vegetal que comprende una pared celular.

Además de los aspectos y realizaciones ilustrativos que se describen aquí, otros aspectos y realizaciones serán evidentes a la vista de las siguientes descripciones.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 representa fotografías de células individuales de BY2 visualizadas utilizando un microscopio de contraste de interferencia diferencial unido a un sistema de imagen confocal (cuadro A) . El cuadro B muestra una vista en microscopio óptico de una sola célula de una variante de BY2 que está teñida con I2KI para resaltar el plástido (Amiloplasto) .

La figura 2, cuadro A, representa células fotoautótrofas de tabaco (NT1) mantenidas en medio mínimo y 5% de dióxido de carbono visualizadas en microscopio óptico, donde son visibles los cloroplastos prominentes. La figura 2, cuadro B, muestra células NT1 similares visualizadas bajo un microscopio de fluorescencia con cloroplastos activos que fluorescen en rojo.

La figura 3 muestra agregados en suspensión de BY2 tratados con fluoresceína SAMSA en solitario y con GNPs revestidas con fluoresceína SAMSA. La figura 3, cuadro A, muestra una imagen DIC de células tratadas con fluoresceína SAMSA en solitario mientras que la figura 3, cuadro B, muestra la imagen fluorescente de las mismas células. La figura 3, cuadro C, muestra una imagen DIC de células tratadas con GNPs revestidas con fluoresceína SAMSA mientras que la figura 3, cuadro D, muestra la imagen fluorescente de las células tratadas con las GNPs revestidas con fluoresceína SAMSA. Se indican las posiciones del núcleo (Nu) y de la pared celular (CW, por sus siglas en inglés) .

La figura 4 muestra células individuales tratadas con GNPs revestidas con fluoresceína SAMSA bajo un microscopio de gran aumento. El cuadro B muestra la presencia de gran número de GNPs en el nucleolo. El cuadro A muestra una vista de campo brillante del mismo nucleolo mostrado en el cuadro B bajo un plano focal diferente.

La figura 5 muestra células fotoautotrófas tratadas con GNP revestida con fluoresceína SAMSA. El cuadro A muestra células hialinas en agrupaciones de 3-4 células con cloroplastos grandes que revisten la cara interior de la pared celular. El cuadro B muestra la acumulación de nanopartículas en el cloroplasto. Los cuadros C y D muestran un aumento a más potencia de un solo cloroplasto usando un microscopio fluorescente. Las nanopartículas son visibles en la membrana tilacoidal del cloroplasto y están intercaladas entre los pigmentos clorofílicos autofluorescentes rojos.

La figura 6 muestra imágenes microscópicas reflectantes y fluorescentes de células que contienen nanopartículas. El cuadro A de la figura 6 muestra una imagen reflectante en la que se ven preferentemente las GNPs. El cuadro B muestra partículas fluorescentes dentro del fondo de cloroplasto autofluorescente rojo. Una imagen reflectante y fluorescente combinada se muestra en el cuadro C, en el que las partículas fluorescentes amarillas están dentro de los límites del cloroplasto.

La figura 7 muestra una representación gráfica de un posible esquema de transformación de acuerdo con una realización de la presente invención.

La figura 8 muestra la interiorización celular de GFP visualizada a través de microscopia reflectante después de dos horas de tratamiento. Los cuadros A y A1 muestran células control no tratadas bajo un microscopio DIC (cuadro A) , y células tratadas con Au-NP unido a GFP visualizadas bajo un microscopio DIC (cuadro A1) ; Los cuadros B y B1 muestran células control bajo un microscopio de reflectancia (cuadro B) , y células tratadas con Au-NP unido a GFP visualizadas... [Seguir leyendo]

1. Un método para introducir una molécula de interés en una célula vegetal que tiene pared celular, que comprende:

i) sub-cultivar un cultivo en suspensión vegetal de una semana de antigüedad que comprende una célula vegetal que tiene pared celular en un medio de cultivo reciente que contiene una cantidad eficaz de un inhibidor de 5 microtubulina durante 4 a 7 días, con lo que se produce un subcultivo vegetal que comprende la célula vegetal que tiene una pared celular;

ii) revestir una nanopartícula que tiene un diámetro menor que 100 nm con una molécula de interés;

iii) poner el subcultivo vegetal y la nanopartícula revestida en contacto entre sí; y

iv) incubar conjuntamente el subcultivo vegetal y la nanopartícula revestida durante al menos 20 minutos, para 10 permitir la captación de la nanopartícula y la molécula de interés en la célula vegetal que comprende una pared celular.

2. El método según la reivindicación 1, en donde revestir una nanopartícula con una molécula de interés comprende inmovilizar la molécula de interés a través de absorción no covalente sobre la superficie de la nanopartícula.

3. El método según la reivindicación 1, que comprende además absorber la molécula de interés en la nanopartícula.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la nanopartícula es una nanopartícula de oro.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la molécula de interés es una molécula de ácido nucleico o de fluoresceína.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además selecconar la célula para la 20 integración estable de la molécula de interés.

Figura 2

Figura 3 Figura 4

Figura 5

Figura 8

Figura 9

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14

Figura 15