Toxinas Cry insecticidas DIG-3.

Un polipéptido aislado que comprende un segmento de toxina de núcleo seleccionado del grupo que consiste en

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO:

2;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos identidad de secuencia de 90% con la secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO: 2;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, deleciones, o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente a la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o uno de sus fragmentos activo como insecticida..

Toxinas Cr y insecticidas DIG-3.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica utilidad a la solicitud de patente provisional de EE.UU. No.61/170.189, presentada el 17 de abril de 2009. 5

Campo de la invención Esta invención se refiere a nuevas toxinas Cr y insecticidas y a su empleo para controlar insectos.

Antecedentes de la invención El Bacillus thuringiensis (B.t, ) es una bacteria que lleva la tierra vegetal, que produce proteínas cristal pesticidas conocidas como delta endotoxinas o proteínas Cr y . Las proteínas Cr y son intoxicantes orales que ejercen su función 10 actuando sobre células del intestino medio de insectos susceptibles. Una lista extensa de delta endotoxinas se mantiene y actualiza regularmente en http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html.

El barrenador europeo del maíz (ECB) , Ostrinia nubilalis (Hübner) , es la plaga de insectos más dañina del maíz en los Estados Unidos y Canadá, y ocasiona una pérdida de ingresos estimada en 1 billón de dólares cada año debida a pérdida del rendimiento de cultivos y a los gastos ocasionados para el control de los insectos (Witkowski et al., 15 2002) . Genes que expresan maíz transgénico codifican las proteínas Cr y , más especialmente las Cr y 1Ab, Cr y 1Ac o Cr y 1F, que proporcionan niveles comerciales de eficacia contra ECB,

A pesar del éxito del maíz transgénico resistente a ECB, la posibilidad del desarrollo de poblaciones resistentes a insectos amenaza la durabilidad a largo plazo de proteínas Cr y en el control de ECB y crea la necesidad de descubrir y desarrollar nuevas proteínas Cr y para el control de ECB y otras plagas. La resistencia de insectos a 20 proteínas Cr y de B.t. puede desarrollarse mediante varios mecanismos (Heckel et al., 2007, Pigott y Ellar, 2007) . Clases de proteínas receptoras múltiples de proteínas Cr y han sido identificadas dentro de insectos, y existen muchos ejemplos dentro de cada clase de receptores. La resistencia a una proteína Cr y particular puede desarrollarse, por ejemplo, por medio de una mutación dentro de la parte de unión de la toxina de un dominio de cadherina de una proteína receptora. Otros medios de resistencia pueden obtenerse a través de una proteasa que 25 procesa una protoxina. Así pues, la resistencia a toxinas Cr y en especies de lepidópteros tiene una base genética compleja, con al menos cuatro genes de resistencia diferentes, importantes. Insectos lepidópteros resistentes a proteínas Cr y han sido desarrollados en el campo dentro de las especies Plutella xylostella (Tabashnik, 1994) , Trichoplusia ni (Janmaat y Myers 2003, 2005) , y Helicoverpa zeae (Tabashnik et al., 2008) . El desarrollo de nuevas proteínas Cr y de alta potencia proporcionaría útiles adicionales para la regulación de ECB y otras plagas de 30 insectos. Las proteínas Cr y con modos de acción diferentes producidas en combinación con maíz transgénico evitarían desarrollo de resistencia de insectos a ECB y protegería la utilidad a largo plazo de la metodología a B.t. para el control de plagas de insectos.

Compendio breve de la invención La presente solicitud se refiere a toxinas Cr y insecticidas, que incluyen la toxina designada en esta memoria como 35 DIG-3 así como variantes de DIG-3, ácidos nucleicos que codifican estas toxinas, métodos de regulación de plagas empleando las toxinas, métodos de producción de las toxinas en células de huéspedes transgénicos, y plantas transgénicas que producen las toxinas. La secuencia de aminoácidos predicha de la toxina DIG-3 de tipo natural se indica en SEQ ID NO:2.

Como se describe en el Ejemplo 1, se aisló un ácido nucleico que codifica la proteína DIG-3 de una cepa de B.t. 40 diseñada internamente por Dow AgroScience LLC como PS46L. Se determinó la secuencia de ácidos nucleicos de la región codificante de longitud total y se dedujo la secuencia de proteínas de longitud total de la secuencia de ácidos nucleicos. La toxina DIG-3 tiene alguna semejanza con Cr y 1BII (Genbank Accession No. AAM93496) y otras proteínas de tipo Cr y 1B de B. thuringiensis (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro, html) .

También se describen en esta memoria variantes activas como insecticida de la toxina DIG-3, y se denominan 45 colectivamente como toxinas DIG-3.

Las toxinas DIG-3 pueden emplearse también en combinación con metodologías de RNAi para el control de otras plagas de insectos. Por ejemplo, puede emplearse DIG-3 en plantas transgénicas en combinación con un dsRNA para la expresión de un gen esencial en la raíz de maíz o de un gen esencial en una plaga de insectos. Tales genes diana incluyen, por ejemplo, ATPase, ARF-1, Act42A, CHD3, EF-1α y TFIIB vacuolares. Un ejemplo de un gen diana 50 adecuado es ATPase vacuolar, descrito en el documento WO2007/035.650.

Se indica en esta memoria que las toxinas DIG-3 son activas contra poblaciones de barredor europeo del maíz y la palomilla dorso de diamante que son resistentes a las toxinas Cr y 1F y Cr y 1A, Por consiguiente, las toxinas DIG-3 son candidatos ideales para emplear para controlar plagas de lepidópteros. Las toxinas pueden emplearse solas o en combinación con otras toxinas Cr y tales como Cr y 1F, Cr y 1Ab y Cr y 1Ac, para controlar el desarrollo de poblaciones de insectos resistentes.

Fragmentos activos desde el punto de vista insecticida de SEQ ID NO:2 y nucleótidos que codifican tales fragmentos, son aspectos de la invención.

En una realización la invención proporciona un polipéptido de toxina DIG-3 aislado que comprende un segmento de 5 toxina de núcleo seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO: 2;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia de 90% con la secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO: 2;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO:2 con hasta 10 20 sustituciones, deleciones o modificaciones que no afectan adversamente a la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO: 2.

En una realización la invención proporciona un polipéptido de toxina DIG-3 aislado que comprenden un segmento de toxina de núcleo seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de restos 73 a 643 de SEQ ID NO:2; 15

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia de 90% con la secuencia de aminoácidos de restos 73 a 643 de SEQ ID NO:2;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de restos 73 a 643 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, deleciones o modificaciones que no afectan adversamente a la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2. 20

En otra realización la invención proporciona un polipéptido de toxina DIG-3 aislado que comprende un segmento de toxina de núcleo de DIG-3 seleccionado de grupos que consisten en:

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de restos 1 a 643 de SEQ ID NO.2;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una identidad de secuencia de 90% con la secuencia de aminoácidos de restos 1 a 643 de SEQ ID NO:2; 25

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de restos 1 a 643 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, deleciones o modificaciones que no afectan adversamente a la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2.

Por "aislado" los solicitantes indican que las moléculas de polipéptido o de DNA han sido retiradas de su medio ambiente nativo y han sido colocadas en un medio ambiente diferente por la mano del hombre. 30

En otra realización la invención proporciona una planta que comprende una toxina DIG-3.

En otra realización la invención proporciona un método para regular una población de plaga que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz como pesticida de una toxina DIG-3.

En otra realización la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una toxina DIG-3.

En otra realización la invención proporciona una construcción de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos 35 que codifica una toxina de DIG-3 ligada de modo operable a un promotor que no procede de Bacillus thuringiensis y que es capaz de impulsar expresión en una planta. La invención proporciona asimismo una planta transgénica que comprende la construcción de DNA incorporada de modo estable en su genoma... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que comprende un segmento de toxina de núcleo seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO:2;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos identidad de secuencia de 90% con la secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO: 2; 5

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de restos 113 a 643 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, deleciones, o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente a la expresión o actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o uno de sus fragmentos activo como insecticida..

2. El polipéptido aislado según la reivindicación 1, que comprende un segmento de toxina de núcleo seleccionado del grupo que consiste en: 10

(a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de restos 73 a 643 o 1 a 643 de SEQ ID NO:2;

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos identidad de secuencia de 90% con la secuencia de aminoácidos de restos 73 a 643 o 1 a 643 de SEQ ID NO:2;

(c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de restos 73 a 643 o 1 a 643 de SEQ ID NO:2 con hasta 20 sustituciones, deleciones, o modificaciones de aminoácidos que no afectan adversamente a la expresión o 15 actividad de la toxina codificada por SEQ ID NO:2; o uno de sus fragmentos activo como insecticida.

3. El polipéptido según la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5.

4. Una planta transgénica que comprende el polipéptido según la reivindicación 1.

5. Un método para controlar una población de plaga que comprende poner en contacto dicha población con una 20 cantidad eficaz como pesticida del polipéptido según la reivindicación 1.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido según la reivindicación 1.

7. El ácido nucleico aislado según la reivindicación 6, en donde dicho ácido nucleico comprende SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.

8. Una constricción de DNA que comprende la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 7, ligada de modo 25 operable a un promotor que no proviene de Bacillus thuringiensis y que es capaz de inducir expresión en una planta.

9. Una planta transgénica que comprende la construcción de DNA según la reivindicación 8, incorporada de modo estable en su genoma.

10. La planta transgénica según la reivindicación 9, que comprende, además, un polinucleótido que codifica una proteína Cr y 1F. 30

11. La planta transgénica según la reivindicación 10, en donde dicha planta es maíz o una planta vegetal.

12. Una célula de planta de maíz que comprende la construcción de DNA según la reivindicación 8, y opcionalmente un polinucleótido que codifica una proteína Cr y 1F.

13. Una célula de una planta vegetal que comprende la construcción de DNA según la reivindicación 8, y opcionalmente, un polinucleótido que codifica una proteína Cr y 1A. 35

14. Un método para proteger una planta de una plaga que comprende introducir en dicha planta la construcción según la reivindicación 8.

15. El polipéptido según la reivindicación 1, que tiene actividad contra barrenador europeo del maíz.

16. El método según la reivindicación 5, en donde dicha población de plaga es una población de barrenador europeo del maíz que es resistente a Cr y 1F, o dicha población de plaga es una población de palomilla dorso de 40 diamante que es resistente a una Cr y 1A.

17. Un método de control de un lepidóptero, cuyo método comprende proporcionar un polipéptido según la reivindicación 1 a dicho lepidóptero.

18. El método según la reivindicación 17, en donde dicho lepidóptero es un barrenador europeo del maíz, y dicho método comprende, además, proporcionar una Cr y 1F a dicho lepidóptero.

19. El método según la reivindicación 17, en donde dicho lepidóptero es una palomilla dorso de diamante, y dicho método comprende, además, proporcionar una Cr y 1Ab y/o una Cr y 1Ac a dicho lepidóptero.

20. El método según la reivindicación 17, en donde dicho lepidóptero es un barrenador europeo del maíz que es 5 resistente a Cr y 1F.

21. El método según la reivindicación 17, en donde dicho lepidóptero es una palomilla dorso de diamante que es resistente a una Cr y 1A,

22. Una semilla transgénica de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 4, .

9. 11.