Solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica y solución condensada de la misma.

Una solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica para eluir un medio de inclusión que contiene parafina de un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido incluida en dicho medio y para recuperar la antigenicidad de dicha muestra de tejido,

siendo dicha solución de pretratamiento utilizable tres o más veces, comprendiendo dicha solución de pretratamiento:

un agente de recuperación de antígeno, que permite la recuperación de la antigenicidad por tratamiento térmico, un primer tensioactivo no iónico,

un segundo tensioactivo no iónico, y

ciclodextrina o un derivado de la misma,

siendo el resto no menos del 80 % en masa de agua

en el que un contenido de dicho agente de recuperación de antígeno es tal que un pH de dicha solución de pretratamiento es 5,0 a 10,0,

en el que dichos primer y segundo tensioactivos no iónicos son un tensioactivo no iónico polioxietilen alquil fenil éter y un tensioactivo no iónico polioxietilen sorbitán y

en el que un contenido de dicha ciclodextrina o un derivado de la misma es del 0,01 al 1,0 % en masa.

Solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica y solución condensada de la misma La presente invención se refiere a una solución de pretratamiento y a una solución concentrada de la misma para la tinción inmunohistoquímica, solución que permite llevar a cabo la tinción inmunohistoquímica en un breve tiempo y con menos mano de obra, incluyendo la tinción inmunohistoquímica: la elución en un medio de inclusión que contiene parafina de un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido como un antígeno incluido en el medio; la recuperación del antígeno; el lavado; la reacción con un anticuerpo y la tinción. En particular, la presente invención se refiere a una solución de pretratamiento y a una solución concentrada de la misma para la tinción inmunohistoquímica, solución que vale tanto para eluir un medio de inclusión que contiene parafina para la tinción inmunohistoquímica de un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido incluida en el medio como para recuperar la antigenicidad, lo que permite la suficiente intensidad de la tinción en la tinción inmunohistoquímica subsiguiente y que mantiene el medio de inclusión incluido dispersado en la misma, incluso después de su primer

uso y que se puede utilizar tres o más veces.

En patología, el pretratamiento de desparafinización y recuperación del antígeno para la tinción inmunohistoquímica de un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido por lo general incluye, como se describe en la publicación no de patente 1: la primera etapa de desparafinización pasando un corte de tejido incluido en parafina fijado en formol a través de un capa de disolvente orgánico, tal como xileno, benceno o tolueno, tres veces durante tres minutos cada uno; la segunda etapa de rehidratación del portaobjetos de vidrio y la muestra de tejido haciéndoles pasar a través de una solución anfifílica, tal como etanol, cuatro veces durante tres minutos cada una; y la tercera etapa de recuperación del antígeno de la muestra de tejido rehidratada mediante tratamiento térmico de la muestra de tejido rehidratada sumergida en una solución de recuperación del antígeno, tal como un tampón de citrato o una solución de Tris-EDTA.

Los disolventes orgánicos utilizados en la primera etapa del pretratamiento, tal como xileno, benceno, o tolueno, son altamente tóxicos y volátiles, lo que requiere un equipo de salida de gases, tal como un tubo de aspiración, lo que afecta negativamente al ambiente en el que trabajan los técnicos.

Como sustituto de los disolventes orgánicos que están asociados a tantas desventajas, hay comercializados agentes de desparafinización altamente seguros, tales como Hemo-De (nombre comercial, fabricado por FALMA) , un disolvente orgánico extraído y purificado a partir de cáscaras de cítricos, Clear-Plus y Hemo-Clear (ambos nombres comerciales, fabricados por FALMA) que utilizan hidrocarburos alifáticos (alcanos) y Tissue Clear (nombre comercial,

fabricado por SAKURA FINETEK JAPAN CO., LTD.) .

En lugar de utilizar los agentes de desparafinización altamente seguros, son deseables métodos más convenientes en los que los tres pasos del tratamiento previo se realizan simultáneamente en una sola solución, habiéndose hecho ya algunas propuestas.

Por ejemplo, la Publicación de Patente 1 propone un proceso de pretratamiento en el que la desparafinización y la recuperación del antígeno se realizan simultáneamente por calentamiento, a una temperatura mayor que el punto de fusión de la parafina, una muestra de tejido incluidas en una solución que contiene un disolvente orgánico solubilizador de parafina seleccionado de hidrocarburo aromático, un terpeno, o un hidrocarburo isoparafínico, un 45 disolvente orgánico polar, un componente antigénico a recuperar y un tensioactivo. La Publicación de Patente 1 también divulga que, para la eliminación del agente tensioactivo residual en una etapa de lavado tras el proceso de pretratamiento, la solución de lavado puede contener ciclodextrina, la cual se une al agente tensioactivo.

Por otra parte, la Publicación de Patente 1 divulga en el Ejemplo 7 que, cuando se utiliza consecutivamente la solución mencionada anteriormente en el pretratamiento, la parafina residual eluida en la solución después del pretratamiento se adhiere al siguiente portaobjetos, de modo que esta solución no es adecuada para uso consecutivo.

Además, cuando se prepara una solución de la composición divulgada en la Publicación de Patente 1 para tener un 55 pH alcalino, en la tinción inmunohistoquímica que sigue al pretratamiento, el portaobjetos de vidrio con la muestra de tejido adherida al mismo tiende a repeler el reactivo de tinción en las porciones que no contienen muestra de tejido, dando como resultado una tinción desigual.

Las Publicaciones de Patente 2 y 3 divulgan que la desparafinización y la recuperación del antígeno pueden efectuarse simultáneamente usando una solución que contiene diversos tampones, tensioactivos, etilenglicol y similares, de la misma manera como en el proceso de tratamiento previo divulgado en la Publicación de Patente 1.

Sin embargo, en estas publicaciones, el uso consecutivo de la solución de pretratamiento no se pretende que sea similar a la solución de la Publicación de Patente 1 y no hay descripción de una tecnología, tal como para la 65 dispersión de la parafina eluida en la solución, o similares. Por lo tanto, es probable que las soluciones de pretratamiento divulgadas en estas publicaciones, cuando se utilizan consecutivamente, también tengan los mismos

problemas que los de la Publicación de Patente 1.

A propósito, algunas soluciones de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica que efectúan la desparafinización y la recuperación del antígeno simultáneamente ya están en el mercado, tales como las divulgadas en las publicaciones de patente anteriores, incluyendo Trilogy (nombre comercial, fabricado por Cell Marque Corporation) para un solo uso, o la Target Retrieval Solution pH 9 (3-in-1) (nombre comercial, fabricado por DAKO) para su uso tres veces consecutivas a la semana.

Las composiciones de estos productos comerciales no son conocidas, pero no contienen ciclodextrina. Además, en todos estos productos, la parafina hidrófoba eluida en la solución de pretratamiento durante el uso a menudo flota en la superficie de la solución.

Dicha parafina insoluble en la superficie de la solución se adhiere a un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido cuando se extrae de la solución, de modo que se requieren más etapas de lavado antes de la tinción posterior,

lo que complica la operación. En caso contrario, la parafina insoluble afecta negativamente a la tinción inmunohistoquímica posterior. Además, cuando la tinción se lleva a cabo en un sistema de tinción inmunohistoquímica automático, la parafina insoluble puede afectar negativamente a la tinción.

Publicaciones de patente Publicación de Patente 1: JP-2001-505297-A Publicación de Patente 2: JP-2003-526086-A Publicación de Patente 3: US-6649368-B1

Publicaciones no de Patente La Publicación no de Patente 1: “Koso Koutai Hou” (Immunoenzymatictechnique) , Revised 4th Edition, Watanabe y Nakane, Kakusai Kikaku (2002)

El documento US 2005/118725 describe reactivos para su uso en un entorno automatizado para acondicionamiento celular de muestras biológicas. El documento US 2005/118725 también describe reactivos para su uso en un entorno automatizado para la eliminación o ataque ácido de medios de inclusión.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar una solución de pretratamiento para tinción inmunohistoquímica que sirva en la tinción inmunohistoquímica tanto para eluir un medio de inclusión que contiene parafina de un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido en forma de un corte de tejido en rodajas adherido al portaobjetos e incluido en el medio como para recuperar la antigenicidad de la muestra de tejido, que permite la intensidad suficiente de la tinción en la tinción inmunohistoquímica posterior, lo que mantiene el medio de inclusión eluido dispersado en la misma, incluso después de su primer uso, que es utilizable tres o más veces consecutivas y que es perfectamente seguro.

Es otro objetivo de la presente invención proporcionar una solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica que resuelva los problemas anteriores, y que, tras la tinción posterior a la elución de un medio de inclusión que contiene parafina de un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido en la forma de un corte de 45 tejido en rodajas adherido al portaobjetos e incluido en el medio y la recuperación del... [Seguir leyendo]

1. Una solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica para eluir un medio de inclusión que contiene parafina de un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido incluida en dicho medio y para recuperar la antigenicidad de dicha muestra de tejido, siendo dicha solución de pretratamiento utilizable tres o más veces, comprendiendo dicha solución de pretratamiento:

un agente de recuperación de antígeno, que permite la recuperación de la antigenicidad por tratamiento térmico, un primer tensioactivo no iónico, un segundo tensioactivo no iónico, y ciclodextrina o un derivado de la misma, siendo el resto no menos del 80 % en masa de agua en el que un contenido de dicho agente de recuperación de antígeno es tal que un pH de dicha solución de pretratamiento es 5, 0 a 10, 0,

en el que dichos primer y segundo tensioactivos no iónicos son un tensioactivo no iónico polioxietilen alquil fenil éter y un tensioactivo no iónico polioxietilen sorbitán y en el que un contenido de dicha ciclodextrina o un derivado de la misma es del 0, 01 al 1, 0 % en masa.

2. La solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que un contenido de dicho tensioactivo no iónico polioxietilen alquil fenil éter es del 0, 01 al 1, 0 % en masa y un contenido de dicho tensioactivo no iónico polioxietilen sorbitán es del 0, 3 al 3, 0 % en masa.

3. La solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que

comprende además una solución anfifílica. 25

4. La solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho agente de recuperación de antígeno se selecciona de un tampón citrato, un tampón citrato mezclado con un agente quelante, un tampón SSC, un tampón SSC mezclado con un agente quelante o tampones Tris mezclados con un agente quelante.

5. La solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho tensioactivo no iónico polioxietilen alquil fenil éter es al menos uno de NP-40, Triton X-100, Triton X-114 o IGEPAL CA-630 y dicho tensioactivo no iónico polioxietilen sorbitán es al menos uno de Tween 20, Tween 40 o Tween 80.

6. La solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha ciclodextrina o un derivado de la misma es al menos una de α-ciclodextrina, β-ciclodextrina, γ-ciclodextrina, hidroxialquil-α-ciclodextrina, hidroxialquil-β-ciclodextrina e hidroxialquil-γciclodextrina.

7. La solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde dicha solución anfifílica es al menos una de etilenglicol, propilenglicol o 1, 3butilenglicol.

8. Un concentrado de una solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica para eluir un medio de inclusión que contiene parafina de un portaobjetos de vidrio con una muestra de tejido incluida en dicho medio y para recuperar la antigenicidad de dicha muestra de tejido, comprendiendo dicho concentrado de solución de pretratamiento:

un agente de recuperación del antígeno, que permite la recuperación de la antigenicidad por tratamiento térmico, un primer tensioactivo no iónico, un segundo tensioactivo no iónico, y ciclodextrina o un derivado de la misma, siendo el resto agua, pero comprendiendo no menos del 80 % en masa de agua

en el que dichos primer y segundo tensioactivos no iónicos son un tensioactivo no iónico polioxietilen alquil fenil éter y un tensioactivo no iónico polioxietilen sorbitán en donde dicho concentrado de solución de pretratamiento es para uso como solución de pretratamiento para la tinción inmunohistoquímica a un pH predeterminado mediante la adición de una cantidad predeterminada de agua a la misma, siendo dicho pH predeterminado de 5, 0 a 7, 0.

9. Un concentrado de acuerdo con la reivindicación 8, en el que un contenido de dicho tensioactivo no iónico polioxietilen alquil fenil éter es del 0, 1 al 10, 0 % en masa, y un contenido de dicho tensioactivo no iónico polioxietilen sorbitán es del 3, 0 al 30, 0 % en masa y un contenido de dicha ciclodextrina o un derivado de la misma es del 0, 1 al 10, 0 % en masa.

10. Un concentrado de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9 para la tinción inmunohistoquímica, que comprende

además una solución anfifílica.

11. Un concentrado de acuerdo con la reivindicación 10 para la tinción inmunohistoquímica, en el que dicha solución anfifílica es al menos una de etilenglicol, propilenglicol o 1, 3-butilenglicol. 5

12. Un concentrado de solución de pretratamiento de dos partes para la tinción inmunohistoquímica, consistiendo dicha solución de pretratamiento de dos partes en una primera parte de concentrado de solución y una segunda parte de concentrado de solución,

en donde dicha primera parte de concentrado de solución comprende un agente de recuperación de antígeno, que permite la recuperación de la antigenicidad por tratamiento térmico, en donde dicha segunda parte de concentrado de solución comprende un tensioactivo no iónico polioxietilen alquil fenil éter, un tensioactivo no iónico polioxietilen sorbitán y ciclodextrina o un derivado de la misma, en donde dicha primera parte de concentrado de solución y dicha segunda parte de concentrado de solución están mezcladas con una cantidad predeterminada de agua para preparar una solución de pretratamiento que tiene un pH de 8, 0 a 10, 0 antes de su uso.

13. Un concentrado de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha segunda parte de concentrado de solución comprende además una solución anfifílica. 20

14. Un concentrado de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha solución anfifílica es al menos una de etilenglicol, propilenglicol o 1, 3-butilenglicol.

15. Un concentrado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que un contenido de dicho

tensioactivo no iónico polioxietilen alquil fenil éter es del 0, 1 al 10, 0 % en masa, y un contenido de dicho tensioactivo no iónico polioxietilen sorbitán es del 3, 0 al 30, 0 % en masa y un contenido de dicha ciclodextrina o un derivado de la misma es del 0, 1 al 10, 0 % en masa.