Reparto mediado de nanopartículas de nucleasas específicas de secuencias.

Un método de introducción de una nucleasa específica de secuencia (SSN) en una célula vegetal,

método que comprende:

el recubrimiento de una nanopartícula con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular;

poner en contacto la célula que tiene una pared celular y la nanopartícula recubierta entre sí; y

permitir la absorción de la nanopartícula y la SSN en la célula vegetal que consta de una pared celular.

Reparto mediado de nanopartículas de nucleasas específicas de secuencias REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. 61/167,389 presentada el 7 de abril, 29. Antecedentes de la invención

Las propiedades únicas de las nanopartículas pueden ser explotadas para el reparto de ADN en las células. Entre las nanopartículas investigadas (por ejemplo, tungsteno, aluminio, níquel, etc.), las nanopartículas de oro (GNP) tienden a ser excelentes candidatos para el reparto de ADN. La baja citotoxicidad y la facilidad de funcionalización con diversos ligandos de importancia biológica hacen de las nanopartículas de oro una opción preferencial para la transformación. Las nanopartículas de oro pueden variar en tamaño de 1.2 nm-6 nm. La síntesis de uso común de GNP produce una superficie con carga negativa (por ejemplo, recubrimiento de citrato) para partículas de 2 -4 nm, mientras que las GNP de un rango más pequeño 1-1 nm, se cargan positivamente. El ADN del plásmido, que es suficientemente flexible para desenrollar parcialmente sus bases, puede ser expuesto a nanopartículas de oro. En el caso de las GNP funcionalizadas con citrato el ADN del plásmido se pueden desenrollar parcialmente. Las cargas negativas en el esqueleto del ADN son suficientemente distantes de modo que las fuerzas de van der Waals atractivas entre las bases y las nanopartículas de oro causan que el ADN del plásmido se una y recubra la superficie de la partícula de oro. Mientras que, en el caso de las GNP cargadas positivamente electrostáticas y las fuerzas de van der Waals pueden contribuir al recubrimiento o unión del ADN.

Además de las nanopartículas de metal, las nanopartículas de semiconductores (por ejemplo, puntos cuánticos) ("QD") dentro del rango de tamaños de 3-5 nm también se han utilizado como portadores para entregar moléculas en las células. El ADN y las proteínas se pueden recubrir o unir a la superficie de QD que es multifuncionalizada con un ligando (véase, por ejemplo, Patolsky, F.,et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (23)). Los QD multifuncionalizados con ácido carboxíllco o amina pueden ser reticulados con moléculas que contienen un grupo tiol (véase, por ejemplo, Dubertret B,.et al., Science 298,1759 (22); Akerman, M. E., W. C. W. Chan, P. Laakkonen, S. N. Bhatla, E. Ruoslahtl, Proc. Nati. Acad. Sel. U.S.A. 99, 12617 (22); Mitchell, G. P., C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc. 121, 8122 (1999)) o un grupo N- hidroxisuccinimil (NHS) éster mediante el uso de protocolos estándar de bioconjugación (véase, por ejemplo, Plnaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (24); Bruchez, M.., M. Moronne, P. Gln, S. Welss, A. P. Alivisatos, Science 281, 213 (1998)). Una forma alternativa es multifuncionalizar los QD a través de la conjugación con estreptavidina. Los conjugados de estreptavidina con proteínas biotiniladas, oligos o anticuerpos (véase, por ejemplo, Dahan M. et al., Science 32,442 (23); Pinaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Welss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (24); Dahan M. et al., Science 32, 442 (23); Wu. X. Y., et al., Nature Blotechnol. 21, 41 (23); Jaiswal, J. K., H. Mattoussi, J. M. Mauro, S. M. Simón, Nature Biotechnol. 21, 47 (23); y Mansson, A., et al., Blochem. Blophys. Res. Commun. 314, 52 9 (24).

Las nanopartículas se han utilizado para el reparto de ADN del plásmido a una variedad de células animales. Se ha encontrado que cuando las nanopartículas recubiertas con ADN se incuban con células que no tienen una pared celular, las células toman las nanopartículas y comienzan a expresar cualquiera de los genes codificados en el ADN. Cuando las nanopartículas se suministran a las células que normalmente se desea que tengan una pared celular, la pared celular se despoja antes de la adición de las partículas a los protoplastos (véase, Torney, F. et al., Nature Nanotechnol. 2, (27). En las células vegetales, los actos de la pared celular como una barrera para el reparto de moléculas aplicadas exógenamente. Muchos métodos invasivos, como la pistola génica (biolística), microinyección, electroporación, y Agrobacterium, se han empleado para lograr el reparto de genes y moléculas pequeñas en estas células vegetales amuralladas. El reparto de moléculas pequeñas y proteínas a través de la pared celular y en la célula vegetal sería ventajoso para el desarrollo de tecnologías de apoyo para la manipulación in vitro e in vivo de células, tejidos y órganos de las plantas intactas.

Aunque bien establecida la introducción de ADN foráneo en bacterias, levaduras, células animales y musgo, además de genes -en una localización genómica predeterminada- sigue siendo un reto importante en las plantas superiores. La integración del transgén específica de sitio se produce a una frecuencia muy baja en las células vegetales, en comparación con la integración aleatoria, incluso cuando el ADN entrante contiene grandes tramos de la secuencia homologa al ADN huésped (Halfter et al. 1992; Lee et al. 199; Mia and Lam (1995). Por ejemplo, un sistema de transfección altamente eficiente basada en Agrobacterium y la selección de herbicida dan lugar a frecuencias de orientación de genes de hasta 5 x 1"4 en arroz. Los intentos para mejorar la eficiencia de la orientación de genes en plantas han incluido el uso de marcadores de selección negativos, y el uso de plantas diseñadas genéticamente para exhibir mayores frecuencias de focalización. No obstante, estos esfuerzos la integración de ADN al azar a través de procesos no homólogos siguen siendo un obstáculo importante para la orientación de genes en las plantas. Dada la utilidad general prevista para la adición de gen

diana en la modificación de los cultivos para la biotecnología agrícola e industrial, se necesita urgentemente una solución a este problema.

En este sentido, se han observado aumentos sustanciales en la frecuencia de la orientación de genes en un amplio rango de sistemas de modelos de plantas y animales después de la inducción de una ruptura de doble cadena en el ADN (DSB) a una localización genómica específica en las células huésped, que estimula un proceso celular nativo, reparación de DSB dirigida de homología. Las endonucleasas específicas de sitio de origen natural cuyos sitios de reconocimiento son raros en el genoma de la plantas se han utilizado de esta manera para conducir la Integración del transgén en una secuencia diana transferida previamente en el genoma de la planta a través de la Integración aleatoria. Estos estudios ponen de relieve el potencial de Inducción de DSB dirigida, para estimular la orientación de genes en células vegetales, aunque el desafío de introducir una DSB en un locus nativo permanece.

En las células animales, la solución a la modulaclón/manlpulaclón del genoma dirigido se consigue a través de una variedad de proteínas de enlace específico de secuencias de nucleótldos tales como proteínas con cremalleras de leuclna, dedo de zinc, etc. Estas proteínas están Implicadas con la regulación de genes como factores de transcripción y/o pueden ser utilizadas para Inducir DSB en una localización genómica nativa. La DSB se puede proveer mediante varias clases diferentes de nucleasas específicas de secuencia, tales como meganucleasas, proteínas con cremalleras de leuclna, dedo de zinc, etc., y más recientemente el desarrollo de nuevas versiones quiméricas de estas proteínas. Una de las mejores proteínas de enlace específicas de nucleótldos descritas son las proteínas dedo de zinc (ZFP). El dedo de zinc C2H2 fue descubierto en el factor de transcripción de anfibios TFIIIA, y desde entonces, se ha encontrado que es el motivo de reconocimiento de ADN más común en todas las especies de metazoos. La estructura cristalina de rayos X de la ZFP C2H2, Zif268, reveló un modo sorprendentemente silábico de reconocimiento de ADN-proteína, con cada dedo de zinc especificando un subsitio de 3 o 4 pb en el contexto de una disposición en tándem, y sugirió la posibilidad de utilizar este motivo peptídico como un andamio para los dominios de enlace de ADN con nuevas especificidades. Desde entonces, se han utilizado con éxito un gran número de ZFP diseñadas para unir nuevas secuencias, en muchos laboratorios diferentes en el contexto de factores de transcripción artificial y otras proteínas quiméricas funcionales. El dominio de la proteína dedo de zinc C2H2 se ha utilizado como un andamio para el ADN específico de secuencia de enlace (Pavelltch and Pabo 1991) y ZFN producidas por la fusión de dominios de la proteína con dedos de zinc con un dominio de nucleasa Independiente de la secuencia derivada de la endonucleasa de restricción de tipo IIS Fokl (Kim et al., 1996).... [Seguir leyendo]

1. Un método de introducción de una nucleasa específica de secuencia (SSN) en una célula vegetal, método que comprende:

el recubrimiento de una nanopartícula con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular;

poner en contacto la célula que tiene una pared celular y la nanopartícula recubierta entre sí; y

permitir la absorción de la nanopartícula y la SSN en la célula vegetal que consta de una pared celular.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además en primer lugar proveer la célula vegetal que tiene una pared celular.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el recubrimiento de una nanopartícula con una SSN, comprende inmovilizar la SSN a través de absorción no covalente en la superficie de la nanopartícula.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además la absorción de la SSN en la nanopartícula.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además permitir la absorción de la nanopartícula en un compartimento de la célula vegetal que consta de una pared celular.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además el recubrimiento de la nanopartícula con una proteína dirigida al compartimento subcelular.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el compartimento se selecciona del grupo que consiste en citosol, núcleo, tonoplasto, plástido, etioplasto, cromoplasto, leucoplasto, oleoplasto, proteinoplasto, amiloplasto, cloroplasto, y el lumen de la doble membrana.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula vegetal que consta de una pared celular es de una planta seleccionada del grupo que consiste de las células de tabaco, zanahoria, maíz, cañóla, colza, algodón, cacahuete, soja, Orvza sp., Arabidopsis sp., Ricinus sp., y de la caña de azúcar.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula vegetal es de un tejido seleccionado del grupo que consiste de embriones, merlstemátlco, callo, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de las raíces, flores, semillas, vainas y tallos.

1. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la nanopartícula se selecciona del grupo que consiste de nanopartículas de oro, nanopartículas recubiertas con oro, nanopartículas porosas, nanopartículas mesoporosas, nanopartículas de sílice, nanopartículas pollmérlcas, nanopartículas de tungsteno, nanopartículas de gelatina, nanocublertas, nanonúcleos, nanoesferas, nanovarlllas, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de semiconductores, puntos cuánticos, nanomatrlces, nanomatrlces dendrímeros y sus combinaciones.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además la derivatización de la superficie de la nanopartícula.

12. El método de la reivindicación 2, en donde la SSN es una nucleasa dedos de zinc formada por una proteína con dedos de zinc con un dominio de nucleasa Independiente de la secuencia preferiblemente derivada de la endonucleasa de

restricción de tipo IIS Fokl.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende además la selección de células que han integrado de forma estable el ZFN.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde las células seleccionadas son células regenerables.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además la regeneración de una planta a partir de las células regenerables.

16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la nanopartícula es una nanopartícula mutifuncionalizada

17. Uso de una nanopartícula recubierta con una SSN en la producción de una célula vegetal transgénica que tiene una 5 pared celular, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un

péptido de penetración celular.

18. Una composición que comprende una nanopartícula recubierta con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular.

19. Una célula vegetal que tiene una pared celular y se transfecta con una nanopartícula recubierta con una SSN, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica o una nanopartícula que está recubierta con un péptido de penetración celular.

2. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la nanopartícula es una nanomatriz

dendrimérica de poliamidoamina (PAMAM).

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica de poliamidoamina (PAMAM).

22. La composición de la reivindicación 18, en donde la nanopartícula es una nanomatriz dendrimérica de poliamidoamina (PAMAM).