Procedimiento de reducción de la expresión génica mediante el uso de codones modificado.

Procedimiento de rdeducción de la cantidad de al menos un polipéptido en una célula de Corynebacterium glutamicum,

que comprende la etapa de expresar en una célula de C. glutamicum una secuencia de nucleótidos modificada en lugar de una secuencia de nucleótidos no modificada que codifica dicho polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos y/o función, en el que dicha secuencia de nucleótidos deriva de la secuencia de nucleótidos no modificada, de forma que al menos un codón de la secuencia de nucleótidos no modificada esté sustituido por un codón de uso menos frecuente de acuerdo con el uso de codones de C. glutamicum, en el que dicho al menos un codón es el codón de iniciación que está sustituido con un codón de iniciación que se usa con menos frecuencia en C. glutamicum, en el que dicho codón de iniciación usado con menor frecuencia es GTG o TTG.

Procedimiento de reducción de la expresión génica mediante el uso de codones modificado Objeto de la invención

La presente invención está dirigida a un procedimiento de reducir la cantidad de al menos un polipéptido en una célula de Corynebacterium glutamicum, que comprende la etapa de expresar en una célula de C. glutamicum una secuencia de nucleótidos modificada en lugar de una secuencia de nucleótidos no modificada que codifica dicho polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos y/o función, en la que dicha secuencia de nucleótidos deriva de la secuencia de nucleótidos no modificada, de forma que al menos un codón de la secuencia de nucleótidos no modificada está sustituida por un codón de uso menos frecuente de acuerdo con el uso de codones de C. glutamicum, en el que dicho al menos un codón es el codón de iniciación que está sustituido con un codón de iniciación que se usa con menos frecuencia en C. glutamicum, en el que dicho codón de iniciación usado con menor frecuencia es GTG o TTG.

También se describen secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido con un uso de codón que se ha ajustado para usar codones que solo se usan rara vez de acuerdo con el uso de codones del organismo huésped.

También se describen el uso de dichas secuencias y procedimientos para producir sustancias químicas finas, tales como aminoácidos, azúcares, lípidos, aceites, hidratos de carbono, vitaminas, cofactores etc.

Antecedentes

En un lote de procesos biotecnológicos es necesario modular la expresión génica. Por tanto, para algunas aplicaciones es necesario aumentar la expresión de un determinado producto génico y para aumentar de este modo la cantidad y/o actividad de, por ejemplo, una proteína en la célula huésped en la que se (sobre) expresa el gen de interés. De forma similar, puede ser necesario reducir la cantidad de expresión de un gen endógeno en una célula huésped. Adicionalmente, puede ser deseable ajustar el nivel de expresión de genes endógenos o heterólogos.

La producción fermentativa de las denominadas sustancias químicas finas normalmente se lleva a cabo en microorganismos tales como Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), Escherichia coli (E.coii), Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), Schizzosaccharomycs pombe (S. pombe), Pichia pastoris (P. pastoris), Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii o Gluconobacter oxydans.

Normalmente se usan y se necesitan sustancias químicas finas que incluyen, por ejemplo, ácidos orgánicos tales como ácido láctico, aminoácidos proteogénicos o no proteogénicos, bases púricas y pirimidínicas, hidratos de carbono, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, lípidos, ácidos grasos saturados e insaturados, en la industria farmacéutica, agrícola, cosmética, así como alimentaria y de piensos.

Como respecto a, por ejemplo, el aminoácido metionina, actualmente la producción anual mundial alcanza aproximadamente 5. toneladas. El proceso de producción industrial actual no es mediante fermentación sino un proceso químico de varias etapas. La metionina es el primer aminoácido limitante en ganado de aves alimentadas y, por ello, se ha aplicado principalmente como suplemento de alimentos. Se han publicado varios intentos en la técnica anterior de producir metionina, por ejemplo usando microorganismos tales como £ coli.

Otros aminoácidos, tales como glutamato, lisina, treonina y treonina, se producen mediante, por ejemplo, procedimientos de fermentación. Para estos fines, determinados microorganismos tales como C. glutamicum han mostrado que son particularmente adecuados. La producción de aminoácidos mediante fermentación tiene la ventaja concreta de que solo se producen L-aminoácidos y que se evitan las sustancias químicas problemáticas para el medio ambiente, tales como los disolventes tal como se usan normalmente en la síntesis química.

Algunos de los intentos en la técnica anterior para producir sustancias químicas finas tales como aminoácidos, lípidos, vitaminas o hidratos de carbono en microorganismos tales como E. coli y C. glutamicum han intentado alcanzar este objetivo mediante, por ejemplo, incremento de la expresión de los genes implicados en las rutas de biosíntesis de las respectivas sustancias químicas finas. Si, por ejemplo, se sabe que una determinada etapa de la ruta biosintética de un aminoácido tal como metionina o lisina es limitante de la velocidad, la sobreexpresión de la respectiva enzima puede permitir la obtención de un microorganismo que da más producto de la reacción catalizada y, por tanto, en última instancia conducirá a una producción aumentada del aminoácido respectivo. De un modo similar, si se sabe que una determinada etapa enzimática en la ruta biosintética de, por ejemplo, un aminoácido deseado no es deseable porque canaliza gran cantidad de energía metabólica a la formación de subproductos no deseados, se puede contemplar regular por disminución la expresión de la actividad enzimática respectiva con el fin de favorecer únicamente las reacciones metabólicas que en última instancia conducen a la formación del aminoácido en cuestión.

Los intentos para aumentar la producción de, por ejemplo, metionina y lisina mediante regulación por aumento y/o disminución de la expresión de los genes implicados en la ruta biosintética de la producción de metionina o lisina se describen en, por ejemplo, los documentos WO 2/129, WO 26897 o W255993.

Normalmente, la sobreexpresión de un gen determinado en un microorganismo tal como E. coli o C. glutamicum u otras células huésped tal como P. pastoris, A. niger o incluso sistemas de cultivo celular de mamíferos se puede conseguir mediante transformación de la respectiva célula con un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada y que además comprende elementos que permiten al vector dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica, por ejemplo, una enzima determinada. Usando este abordaje, las proteínas extrañas, es decir proteínas que están codificadas por secuencias que no se encuentran de forma natural en la célula huésped que se usa para expresión, además de proteínas endógenas específicas de células huésped, se pueden sobreexpresar. Otros procedimientos típicos incluyen incrementar el número de copias de los respectivos genes en el cromosoma, insertando promotores fuertes para regular la transcripción de la copia en el cromosoma de los respectivos genes y potenciar el inicio de la traducción mediante optimización del sitio de unión al rlbosoma (RBS).

Kinnaird y Bums, 1991, Journal of Molecular Biology, 221(3), 733-736 divulgan un raro efecto de codón sobre la velocidad de traducción de un gen de Neurospora. El documento describe que, como resultado de dos mutaciones de desplazamiento de marco que se compensan mutuamente, se generaron tres codones sucesivos con la tercera posición A en el gen de ( glutamato deshidrogenasa específica de NADP: CDH) de Neurospora crassa.

Malumbres et al., 1993, Gene, 134, 15-24 divulga preferencias de codones en Corynebacteria. En particular, el documento describe el análisis del uso de codones (CU) de 34 genes de las especies íntimamente relacionadas Brevibacterium lactofermentum y Corynebacterium glutamicum (BLCG) y la comparación con los de 23 genes de otras especies de Brevibacterium y Corynebacterium. El contenido de G+C de los genes de BLCG se encontró que variaba de 5 a 62 %.

Romero y Garda, 1991, FEMS Microbiology Letters, 84, 325-33 divulga el inicio de la traducción en los codones AUC, AUA y AUU en Escherichia coli.

Charlet et al., 25, Molecular Microbiology, 56(5), 132-1313 divulga una reducción de la expresión de proteínas antigénicas MPB7 y MPB83 en cepas BCG de Mycobacterium bovis debido a una mutación en el codón de iniciación en sigK.

Para la regulación por disminución de la expresión de determinados factores en, por ejemplo, microorganismos, se dispone de una multitud de tecnologías tales como abordajes de genes defectivos, tecnología antisentido, tecnología de ARNI etc. Algunas de las tecnologías para la regulación por disminución de genes conducen a una completa pérdida de la función para los respectivos factores debido a la ausencia de, por ejemplo, cualquier enzima producida. Esto puede suponer un problema cuando el objetivo global es únicamente un determinado grado de reducción en la cantidad de la proteína. En estos casos, se puede eliminar la copia de tipo salvaje del respectivo gen y reemplazarlo con una versión mutante que muestre una menor actividad o que lo exprese a partir de un promotor débil. No obstante, dichos abordajes son bastante molestos y otros medios de reducción... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de rdeducción de la cantidad de al menos un polipéptido en una célula de Corynebacterium glutamicum, que comprende la etapa de expresar en una célula de C. glutamicum una secuencia de nucleótidos modificada en lugar de una secuencia de nucleótidos no modificada que codifica dicho polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos y/o función, en el que dicha secuencia de nucleótidos deriva de la secuencia de nucleótidos no modificada, de forma que al menos un codón de la secuencia de nucleótidos no modificada esté sustituido por un codón de uso menos frecuente de acuerdo con el uso de codones de C. glutamicum, en el que dicho al menos un codón es el codón de iniciación que está sustituido con un codón de iniciación que se usa con menos frecuencia en C. glutamicum, en el que dicho codón de iniciación usado con menor frecuencia es GTG o TTG.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos modificada deriva de la secuencia de nucleótidos no modificada, de forma que al menos un codón adicional de la secuencia de nucleótidos no modificada esté reemplazado en la secuencia de nucleótidos modificada por un codón menos usado de acuerdo con el uso de codones de proteínas abundantes de C. glutamicum.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que al menos un codón de la secuencia de nucleótidos no modificada está reemplazado en la secuencia de nucleótidos modificada por uno de los dos codones menos usados como se expone en la tabla 1.

4. Procedimiento e acuerdo con la reivindicación 3, en el que todos los codones de dicha secuencia de nucleótidos modificada para cada aminoácido son seleccionados del uso de codones de la tabla 3.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que al menos un codón de la secuencia de nucleótidos no modificada está reemplazado en la secuencia de nucleótidos modificada por uno de los dos codones menos usados como se expone en la tabla 2.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha secuencia de nucleótidos modificada usa los codones ACG para treonina; o GAT para ácido aspártico; o GAA para ácido glutámico; o AGA y AGG para arginina y/o TTG para el codón de iniciación.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que todos los codones de dicha secuencia de nucleótidos modificada para cada aminoácido son seleccionados del uso de codones de la tabla 4.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se usa la cepa ATCC 1332 de C. glutamicum o derivados de la misma.

9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el procedimiento es usado para disminuir la expresión de dicho polipéptido en la célula de C. glutamicum cell en al menos 5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 95 %, determinándose la extensión de la reducción de la expresión en comparación con el nivel de expresión del polipéptido que se expresa a partir de la secuencia de nucleótidos no modificada en condiciones comparables.