Receptores estrogénicos y métodos de uso.

Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº:

1, o a un fragmento inmunogénico de la SEC ID Nº: 1 que comprende al menos siete aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 1.

Receptores estrogénicos y métodos de uso Antecedentes de la invención

El estrógeno es un término genérico para los compuestos esteroides que se forman en los ovarios, testículos y posiblemente en la corteza adrenal. Los ejemplos de estrógenos y compuestos que tienen actividad estrogénica incluyen dietilestilbestrol, fosfestrol, hexestrol, fosfato de poliestradiol, broparoestrol, clorotrianiseno, dienestrol, dietilestilbestrol, metestrol, colpormon, equilenina, equilin, estradiol, estriol, estrona, etinil estradiol, mestranol, mexestrol, quinestradiol y quinestrol. Los estrógenos regulan diversos procesos fisiológicos en tejidos reproductores y en tejidos mamarios, cardiovasculares, óseos, hepáticos y cerebrales. Los estrógenos también se usan en anticonceptivos orales. Otros usos de los estrógenos incluyen el alivio de las molestias de la menopausia, inhibición de la lactancia, y tratamiento de la osteoporosis, aborto inminente y diversos trastornos ováricos funcionales. Los antiestrógenos se usan para tratar el carcinoma mamario metastásico y el cáncer de próstata avanzado.

Los efectos de los estrógenos están mediados a través de receptores estrogénicos. El primer receptor estrogénico (RE) se clonó en 1986 (Green et al., Nature, 32: 134 (1986) y Greene et al., Science, 231: 115 (1986)). Hasta 1995, se suponía que solo había un receptor estrogénico responsable de todos los efectos fisiológicos y farmacológicos de los estrógenos y antiestrógenos naturales y sintéticos. Sin embargo, en 1995, se clonó un segundo receptor estrogénico (Kuiper et al., PNAS, 93: 5925 (1996)). El primer receptor estrogénico descubierto se denomina ahora receptor estrogénico alfa (RE-a) y el segundo receptor estrogénico se denomina receptor estrogénico (RE-j3).

El RE-a y el RE-j3 comparten una arquitectura estructural común (Zhang etal., FEBS Letters, 546: 17 (23) y Kong et al., Biochem. Soc. Trans., 31: 56 (23)). Ambos están compuestos por tres dominios funcionales que interaccionan aunque son independientes: el dominio A/B N terminal, el dominio C o de unión a ADN y el dominio D/E/F o de unión a ligando (Figura 1). El dominio N terminal del RE-a codifica una función de activación independiente de ligando (AF-1), una región implicada en la interacción con co-activadores y activación transcripcional de genes diana. El dominio de unión a ADN o dominio C contiene una estructura de dos dedos de cinc, que desempeña una función importante en la dimerización del receptor y en la unión a secuencias de ADN específicas. El dominio D/E/F C terminal es un dominio de unión a ligando que media la unión a ligando, la dimerización del receptor, la translocación nuclear, y una función de transactivación dependiente de ligando (AF-2). Las contribuciones relativas que tanto AF-1 como AF-2 ejercen sobre el control transcripcional varían de una manera específica del promotor de ADN y específica de la célula (Berry et al., EMBO J., 9: 2811 (199) y Tzukerman et al., Mol. Endocrin., 8: 21 (1994)).

Se observó una isoforma del RE-a de 46 kDa que carecía de los primeros 173 aminoácidos del producto génico de longitud completa del gen del RE-a (dominio A/B o AF-1) que derivaba de corte y empalme alternativo del gen del RE-a saltando el exón 1 (Flouriot et al., EMBO J., 19: 4688 (2)). Este suceso de corte y empalme alternativo genera un ARNm que tiene un AUG en una secuencia Kozak favorable para el inicio de la traducción en fase con el resto de la fase de lectura abierta original. Por lo tanto, esta nueva isoforma del RE-a se denominó RE-a46 y la original se denominó RE-a66 (Flouriot et al., EMBO J., 19: 4688 (2)). RE-a46 forma homodímeros y se une a un elemento de respuesta estrogénica (ERE) y también puede formar heterodímeros con RE-a66 (Flouriot etal., EMBO J., 19: 4688 (2)). Los homodímeros de RE-a46 muestran una mayor afinidad por un ERE que los homodímeros de RE-a66. Además, los heterodímeros de RE-a46/66 se forman preferentemente sobre los homodímeros de RE- a66 y RE-a46 actúa competitivamente para inhibir la transactivación mediada por el dominio AF-1 del RE-a66 con ligando, pero efectúa la transactivación dependiente de AF-2 (Floutiot et al., EMBO J., 19: 4688 (2)). Por lo tanto, se pensó que el RE-a46 es una isoforma de origen natural del RE-a que regula la señalización estrogénica mediada por el dominio AF-1 del RE-a66.

El RE-a se expresa aproximadamente en el 15-3 % de las células epiteliales luminales y en absoluto en ninguno de los otros tipos de células en la mama humana normal. Técnicas de inmunofluorescencia de doble mareaje revelan que las células que expresan el RE-a están separadas de las que están marcadas con marcadores de proliferación tanto glándulas mamarias normales tanto de roedores como de seres humanos (Clarke etal., Cáncer Res., 57: 4987 (1997)). La expresión del REa aumenta en las fases muy tempranas de hiperplasia ductal y aumenta incluso más con el aumento de la atipia, de tal manera que la mayoría de las células en hiperplasias ductales atípicas y en cáncer ductal in situ de grado nuclear bajo e intermedio contienen el RE-a (Khan et al., Cáncer Res., 54: 993 (1994) y Lawson et al., Lancet, 351:1787 (1994)). A medida que aumenta la expresión del RE-a, la relación inversa entre la expresión del receptor y la proliferación celular comienza a descompensarse (Shoker et al., Amer. Jour. Path., 155: 1811 (1999)). Aproximadamente el 7 % de los carcinomas de mama invasivos expresan el RE-a y la mayoría de estos tumores contienen células proliferantes positivas al RE-a (Clarke etal., Cáncer Res., 57:4987 (1997)).

Los receptores estrogénicos son miembros de la superfamilia de receptores nucleares de factores de transcripción activados por ligando que controlan numerosos procesos fisiológicos. Este control a menudo se produce a través de la regulación de la transcripción génica (Katzenellenbogen y Katzenellenbogen, Breast Cáncer Res., 2: 335 (2); Hull et al., J. Biol. Chem., 276: 36869 (21); McDonnell y Norris, Science, 296: 1642 (22)). El receptor estrogénico utiliza mecanismos múltiples para activar o reprimir la transcripción de sus genes diana. Estos mecanismos incluyen: (a) interacción directa del receptor ocupado por el ligando con ADN en elementos de respuesta estrogénica seguido por un reclutamiento de complejos correguladores o mediadores transcripcionales, (b) interacción del RE ocupado por ligando con otros factores de transcripción tales como AP-1 (Kushner et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 74: 311 (2)), Sp1 (Safe, Vitam. Horm., 62: 231 (21)) o NF-kB (McKay y Cidlowski, Endocr. Rev., 2: 435 (1999)), o (c) modulación indirecta de la transcripción génica mediante el secuestro de componentes transcripcionales generales/comunes (Harnish et al., Endocrinology, 141: 343 (2) y Speir et al., Circ. Res., 87: 16 (2)). Adicionalmente, la capacidad de un receptor estrogénico para regular la transcripción a través de estos diversos mecanismos parece ser específica del tipo de célula, quizá debido a diferencias en el complemento de factores correguladores transcripcionales disponibles en cada tipo de célula (Cerillo et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 67: 79 (1998); Evans et al., Circ. Res., 89: 823 (21); Maret et al., Endocrinology, 14: 2876 (1999)). Además, la regulación transcripcional depende de la naturaleza del ligando, con diversos moduladores de receptores estrogénicos selectivos naturales y sintéticos que actúan como agonistas o antagonistas de receptores estrogénicos a través de cada uno de estos diversos mecanismos (Shang y Brown, Science, 295: 2465 (22); Katzenellenbogen y Katzenellenbogen, Science, 295: 238 (22); Margeat et al., J. Mol. Biol., 326: 77 (23); Dang et al., J. Biol. Chem., 278: 962 (23)).

Existe otra ruta de señalización mediada por estrógenos, conocida también como ruta de `señalización de membrana, `no clásica o `no genómica, que implica proteínas citoplasmáticas, factores de crecimiento y otras rutas de señalización iniciadas en membrana (Segars et al., Trends Endocrin. Met., 13: 349 (22)). Diversas rutas de señalización intracelulares han mostrado comunicación con efectos rápidos iniciados por estrógenos: la ruta de la adenilato ciclasa (Aronica et al., PNAS, 91: 8517 (1994)), la ruta de la fosfolipasa C (Le Mellay et al., J. Cell. Biochem., 75: 138 (1999)), las rutas activadas por receptores acoplados a la proteína G (Razandi et al., Mol. Endocrin., 13: 37 (1999)) y la ruta de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) (Watters et al., Endocrinology, 138: 43 (1997)). Sin embargo, todas las formas de membrana descritas hasta ahora están relacionadas con el RE-apero no con el RE-p (Segars et al., Trends Endocrin. Met., 13: 349 (22)).

La señalización estrogénica se ha asociado patológicamente... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N2: 1, o a un fragmento inmunogénico de la SEC ID N2: 1 que comprende al menos siete aminoácidos contiguos de la SEC ID N2: 1.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está unido covalentemente a un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico y un marcador detectable.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el compuesto es un agente quimioterapéutico.

7. El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el compuesto es un marcador detectable.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en el que el marcador detectable es un marcador fluorescente.

9. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une específicamente a una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 13-27 de la SEC ID N2:1.

1. Una composición que comprende un anticuerpo de la reivindicación 1.

11. La composición de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Un método para preparar un anticuerpo que comprende administrar a un animal no humano un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N2: 1, o un fragmento inmunogénico que comprende al menos siete aminoácidos contiguos de la SEC ID N2: 1, y aislar el anticuerpo del animal, en donde el anticuerpo aislado se une específicamente a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N2:1.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el polipéptido o el fragmento inmunogénico que comprende al menos siete aminoácidos contiguos de la SEC ID N2: 1 está unido covalentemente a un polipéptido vehículo.

14. El método de la reivindicación 12, en el que el aislamiento comprende obtener del animal una célula que produce el anticuerpo, comprendiendo adicionalmente el método preparar un hibridoma que produce anticuerpos monoclonales usando la célula.

15. Un anticuerpo policlonal aislado mediante un método de la reivindicación 12.

16. Un anticuerpo monoclonal aislado mediante un método de la reivindicación 14.

17. Una célula aislada que comprende una región codificante exógena, en la que la región codificante codifica un primer polipéptido que comprende la SEC ID N2: 2 o un segundo polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 95 % con la SEC ID N2: 2, en la que el segundo polipéptido se une a estrógeno o a tamoxifeno, a 4-OH-tamoxifeno o a ICI-182, 78.

18. Una célula aislada que expresa un polipéptido exógeno a partir de una región codificante, en la que el polipéptido exógeno comprende:

la SEC ID N2: 2, o

una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 95 % con la SEC ID N2: 2 que se une a estrógeno o a tamoxifeno, a 4-OH-tamoxifeno o a ICI-182, 78.

19. La célula aislada de la reivindicación 18, en la que la región codificante está unida operativamente a un promotor constitutivo.

2. La célula aislada de las reivindicaciones 17 o 18, en donde la célula es una célula eucariota.

21. La célula aislada de las reivindicaciones 17 o 18, en donde la célula es una célula procariota.

22. Un método para identificar un agente que se une a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N2: 2, comprendiendo el método:

combinar ex vivo un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N2:1

y un agente en un ensayo de unión competitiva;

detectar la formación de un complejo entre el agente y el polipéptido; y

determinar la capacidad del agente para unirse preferentemente a la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N2: 1.

23. El método de la reivindicación 22, que comprende adicionalmente determinar si el agente se une a un polipéptido que comprende la SEC ID N2:18.

24. El método de la reivindicación 22, que comprende adicionalmente determinar si el agente inhibe la actividad RE- cc36 del polipéptido, en el que la actividad de RE-a36 comprende unión a estrógeno, unión a tamoxifeno, a 4-OH- tamoxifeno o a ICI-182, 78, aumentando la fosforilación de ERK 1/2, o aumentando la fosforilación de Mek 1/2.

25. Un método para detectar ex vivo un polipéptido que comprende:

determinar si una célula expresa un polipéptido que tiene un peso molecular de 36 kDa, medido después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS) y que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N2: 2 o una secuencia con una identidad del 95 % con la misma.

26. Un método para detectar ex vivo un polipéptido que comprende:

determinar si una célula expresa un polipéptido que tiene un peso molecular de 36 kDa, medido después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS) y que comprende la secuencia de aminoácidos 13-27 de la SEC ID N2: 1.

27. El método de las reivindicaciones 25 o 26, en el que la célula es una célula tumoral.

28. El método de la reivindicación 27, en el que el tumor es un tumor mamario.

29. El método de la reivindicación 25, en el que la determinación de si la célula expresa el polipéptido comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID N2: 1, o a un fragmento inmunogénico que comprende al menos siete aminoácidos contiguos de la SEC ID N2: 1.

3. El método de la reivindicación 29, en el que el anticuerpo está unido covalentemente a un marcador detectable.

31. El método de la reivindicación 3, en el que el marcador detectable es un marcador fluorescente.

32. El método de la reivindicación 25 en el que la determinación de si la célula expresa el polipéptido comprende amplificar un polinucleótido de ARNm para formar polinucleótidos amplificados, en el que la amplificación comprende poner en contacto los polinucleótidos obtenidos de la célula con un par de cebadores que amplificarán un polinucleótido de ARNm que comprende la SEC ID N2: 22 o la SEC ID N2: 25, o la combinación de las mismas, en donde la presencia de polinucleótidos amplificados indica que la célula expresa el polipéptido.

33. El método de la reivindicación 32, en el que un cebador del par de cebadores se selecciona de nucleótidos de la SEC ID N2: 22, nucleótidos complementarios a nucleótidos de la SEC ID N2: 25, o la combinación de los mismos, y en el que cada cebador tiene al menos 15 nucleótidos.

34. Un método ex vivo para inhibir la fosforilación de ERK 1/2 o de Mek 1/2 en una célula, comprendiendo el método:

poner en contacto una célula que expresa un polipéptido que tiene un peso molecular de 36 kDa, medido después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS), se une a estrógeno, y comprende una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 13-27 de la SEC ID N2: 1, con el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 9 en una cantidad eficaz para inhibir la unión entre el estrógeno y la SEC ID N2: 2.

35. Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer relacionado con estrógenos en un sujeto en donde el anticuerpo inhibe la unión entre el estrógeno y la SEC ID N2: 2 en una célula que expresa un polipéptido que tiene un peso molecular de 36 kDa, medido después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS), se une a estrógeno y comprende la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 13-27 de la SEC ID N2: 1.

36. Un compuesto para su uso en el tratamiento de un cáncer relacionado con estrógenos en un sujeto, en donde el compuesto comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, inhibe la unión entre el estrógeno y la SEC ID N2: 2 en una célula que expresa un polipéptido que tiene un peso molecular de 36 kDa, medido

después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS), se une a estrógeno y comprende la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 13-27 de la SEC ID N2: 1.

37. Un polipéptido aislado que consta de la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos 13-27 de la SEC ID N2: 1,o los aminoácidos 13-27 de la SEC ID N2: 1 modificados por sustitución o deleción de uno o más aminoácidos contiguos o no contiguos siempre que el polipéptido modificado sea capaz de estimular la producción de anticuerpos que se unan a los restos 13-27 de la SEC ID N2: 1.

38. Un polipéptido aislado que consta de los aminoácidos 1-27 de la SEC ID N2: 1, o los aminoácidos 1-27 de la SEC ID N2: 1 modificados por sustitución o deleción de uno o más aminoácidos contiguos o no contiguos siempre que el polipéptido modificado sea capaz de estimular la producción de anticuerpos que se unan a los restos 1-27 de la SEC ID N2:1.

39. Un fragmento inmunogénico de la SEC ID N2:1 que comprende al menos siete aminoácidos contiguos de la SEC ID N2:1.

4. Un kit que comprende un anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y material de envasado.

41. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en medicina.

42. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 en la fabricación de un agente de diagnóstico para su uso en diagnósticos para diferenciar cáncer positivo a estrógenos y negativo a estrógenos.

43. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en diagnósticos para diferenciar cáncer positivo a estrógenos y negativo a estrógenos.

44. El anticuerpo de la reivindicación 1 que es un fragmento de anticuerpo.

45. Un polipéptido que comprende:

el polipéptido aislado de las reivindicaciones 37 o 38; y un polipéptido vehículo unido covalentemente.

46. Una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 37, 38 o 44.

47. El uso de la reivindicación 35 en donde el cáncer comprende cáncer de mama.

48. El compuesto para el uso de la reivindicación 36 en donde el cáncer comprende cáncer de mama.

49. Uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 en la fabricación de un agente de diagnóstico para diagnosticar en un sujeto cáncer positivo a estrógenos o negativo a estrógenos detectando un polipéptido que tiene un peso molecular de 36 kDa, medido después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS) y que se une a estrógeno o a tamoxifeno, a 4-OH-tamoxifeno o a ICI-182, 78.

5. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como agente de diagnóstico para diagnosticar en un sujeto un cáncer positivo a estrógenos o negativo a estrógenos, detectando un polipéptido que tiene un peso molecular de 36 kDa, medido después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS) y que se une a estrógeno o a tamoxifeno, a 4-OH-tamoxifeno o a ICI-182, 78.