Procedimiento para producir composiciones de VSR estables en almacenamiento.

Un procedimiento para minimizar la pérdida de potencia del VSR durante la liofilización y para producir una composición de virus estable durante el almacenamiento que comprende virus sincitial respiratorio (VSR),

comprendiendo el procedimiento:

(a) congelar una composición de virus de entre aproximadamente 100 μl a aproximadamente 5 ml por debajo de su temperatura de transición vítrea en un tiempo de 60 minutos o menos a una velocidad de -0,5 °C a -2,5 °C por minuto, en el que la composición de virus es formulada en una solución de tampón fosfato de 5,0 mM a aproximadamente 20 mM que comprende sales monobásicas y dibásicas de sodio y/o de potasio y que tiene un pH de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,8; y

(b) liofilizar la composición de virus, en la que la composición de virus liofilizada es estable durante al menos un año a una temperatura de almacenamiento de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 10 °C.

Procedimiento para producir composiciones de VSR estables en almacenamiento

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la virología, la formulación viral y al desarrollo de procesos. Más particularmente, la invención se refiere a procedimientos para minimizar la pérdida de potencia del 5 VSR durante la liofilización y para producir composiciones de virus estables durante el almacenamiento, en las que las composiciones son estables durante el almacenamiento como una composición sólida liofilizada.

Antecedentes de la invención

El virus respiratorio sincitial humano (VSR) y el virus de la parainfluenza (PIV) , miembros de la familia de los paramixovirus, son los principales patógenos responsables de la enfermedad respiratoria grave en lactantes y niños 10 pequeños (Glezen et al., 1981; Chanock et al., 1992; Martin et al., 1978) . Dos grupos del VSR, el grupo A (VSR-A) y el grupo B (VSR-B) , circulan simultáneamente durante las epidemias invernales anuales, aunque normalmente se observa una predominancia de las infecciones del grupo A (McConnochie et al., 1990; Stark et al., 1991) . El PIV de tipo 3 (PIV-3) es una causa frecuente de bronquiolitis, neumonía y crup. Juntos, el VSR y el PIV-3 representan hasta el 30 % de todas las hospitalizaciones de lactantes y niños pequeños por enfermedades de las vías respiratorias 15 (Crowe, 1995) . El PIV de los tipos 1 y 2 (PIV-1 y PIV-2) también son causas frecuentes de crup. El VSR también se ha notificado que produce una morbididad significativa en individuos inmunocomprometidos y en ancianos. Anualmente se producen sesenta y cinco millones de infecciones por VSR en todo le mundo, que dan lugar a 160.000 fallecimientos (Robbins y Freeman, 1988) . Solo en Estados Unidos, 100.000 niños son hospitalizados anualmente con casos graves de neumonía y bronquiolitis a causa de una infección por el VSR (Glezen et al., 1986; 20 Katz, 1985) . Se ha estimado que los cuidados intrahospitalarios y ambulatorios para niños con infecciones por el VSR en EE.UU. en 1992 cuestan más de 340 millones de dólares americanos anuales (Wertz y Sullender, 1992) . Los comités asesores de vacunas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Crowe, 1995) y el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (NIAID) han clasificado al VSR en segundo lugar, detrás del VIH, para el desarrollo de una vacuna, mientras que la preparación de una vacuna eficaz contra el PIV (por ejemplo, PIV 25 de tipo 3) se clasifica en las diez vacunas principales que se consideran prioritarias para desarrollo de vacunas.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de la capacidad para modificar una vacuna eficaz contra el VSR y/o el PIV que pueda prevenir enfermedades respiratorias graves en lactantes, niños pequeños, ancianos e inmunocoprometidos. El uso de VST y/o PIV atenuados vivos para controlar las enfermedades respiratorias es uno de los abordajes más prometedores. Se ha desarrollado una serie de cepas del VSR vivos atenuados y se 30 analizaron en niños seronegativos para el VSR durante los últimos veinte años. Los abordajes más perseguidos para la atenuación viva de VSR han sido VRS sometidos a frío (cp) , mutantes del VSR sensibles a la temperatura (ts) y mutantes del VSR sensibles a la temperatura y sometidos a frío (cpts) (Kneyber y Kimpen, 2002) . Actualmente se están evaluando mutantes del VSR tales como cpts-248, cpts-248/404, cpts-530 y el mutante del PIV-3 cp-45 en laboratorios y ensayos clínicos. 35

Además de la necesidad de identificar y desarrollar una combinación de composiciones inmunogénicas de VSR, PIV o VSR/PIV vivos atenuados eficaz, actualmente existe la necesidad de métodos de producción de composiciones de VSR y/o PIV estables durante el almacenamiento y composiciones inmunogénicas de las mismas. Por ejemplo, el VSR es un virus termolábil, que se inactiva en menos de tres meses durante el almacenamiento a -65 °C a -86 °C (Hambling, 1964; Wulff et al., 1964; Gupta et al., 1996) . Por tanto, es altamente deseable identificar métodos para 40 producir composiciones inmunogénicas del VSR, PIV o VSR/PIV que sean estables durante el almacenamiento.

El documento de Tannock G et al (1987) , Journal of Clinical Microbiology, vol.25, p.1769 - 1771 describes que las cepas del virus sincitial respiratorio liofilizadas en presencia de un estabilizante adecuado se pueden transportar como muestras no refrigeradas sin pérdidas de infectividad indebidas.

El documento WO03086443 describe un procedimiento de preparación de una composición de partículas liofilizadas 45 para la administración intranasal de un material bioactivo, comprendiendo el procedimiento: Pulverizar una formulación líquida que comprende el material bioactivo para formar gotas; congelar las gotas mediante inmersión en un fluido frío; secar las gotas para formar partículas de polvo; y recuperar las partículas, en el que las partículas comprenden un tamaño físico promedio que varía de aproximadamente 10 um a aproximadamente 200 um, preparando de este modo las partículas liofilizadas para administración intranasal (reivindicación 1) . De acuerdo con 50 la reivindicación 3 del documento WO03086443, el material bioactivo puede comprender el virus sincitial respiratorio.

Adicionalmente, potenciar la estabilidad durante el almacenamiento de otras composiciones inmunogénicas se ha reconocido desde hace tiempo como objetivo importante para mejorar el impacto de las vacunas sobre la salud mundial (Melnick y Wallis, 1963; Rasmussen et al., 1973; Ayra, 2001; Hilleman, 1989; Lemon y Milstein, 1994) Por tanto, existe la necesidad en la técnica de formulación de virus y desarrollo de procesos de procedimientos para 55 producir composiciones de virus estables durante el almacenamiento, tales como virus de herpes simple, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de varicela zóster, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la gripe, poliovirus, rinovirus, adenovirus, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de

Norwalk, togavirus, alfavirus, virus de la rubéola, virus de la rabia, virus de Marburg, virus del ébola, virus del papiloma, virus del polioma, metaneumovirus, coronavirus, virus de la estomatitis vesicular, virus de la encefalitis equina venezolana y similares.

Sumario de la invención

La invención, en su sentido más amplio, es como se define en las reivindicaciones independientes. 5

La invención se refiere a procedimientos como se ha definido en las reivindicaciones para minimizar la pérdida de potencia del VSR durante la liofilización y para producir composiciones de virus estables durante el almacenamiento que comprenden un virus sincitial respiratorio (VSR) .

Por tanto, la invención se refiere a un procedimiento para minimizar la pérdida de potencia del VSR durante la liofilización y para producir una composición de virus estable durante el almacenamiento que comprende virus 10 sincitial respiratorio (VSR) , comprendiendo el procedimiento: (a) congelar una composición de virus de entre aproximadamente 100 µl a aproximadamente 5 ml por debajo de su temperatura de transición vítrea en un tiempo de 60 minutos o menos a una velocidad de -0, 5 °C a -2, 5 °C por minuto, en el que la composición de virus se formula en una solución de tampón fosfato de 5, 0 mM a aproximadamente 20 mM que comprende sales monobásicas y dibásicas de sodio y/o de potasio y que tiene un pH de aproximadamente 6, 5 a aproximadamente 7, 8; y (b) liofilizar 15 la composición de virus, en la que la composición de virus liofilizada es estable durante al menos un año a una temperatura de almacenamiento de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 10 °C.

En una realización, la temperatura de transición vítrea es una temperatura de aproximadamente -45 °C y se alcanza en un tiempo de aproximadamente sesenta minutos o menos. En otra realización, la temperatura de transición vítrea es una temperatura de aproximadamente -35 °C y se alcanza en un tiempo de aproximadamente cuarenta minutos o 20 menos. En otra realización más, la temperatura de transición vítrea de aproximadamente -35 °C se alcanza en un tiempo de aproximadamente veinte minutos o menos. En una realización, el volumen de la composición de virus es de aproximadamente 0, 2 ml a aproximadamente 1, 0 ml. En determinadas realizaciones, la composición de virus está comprendida en un medio recipiente adecuado, en la que el medio recipiente se define adicionalmente como un vial, un tubo o un dispositivo de pulverización nasal. En una realización, el VSR se define además como un VSR del 25 grupo A (VSR-A) , un VSR del grupo B (VSR-B) o un VSR recombinante quimérico que comprende uno o más antígenos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para minimizar la pérdida de potencia del VSR durante la liofilización y para producir una composición de virus estable durante el almacenamiento que comprende virus sincitial respiratorio (VSR) , comprendiendo el procedimiento: (a) congelar una composición de virus de entre aproximadamente 100 µl a aproximadamente 5 ml por debajo de su temperatura de transición vítrea en un tiempo de 60 minutos o menos 5 a una velocidad de -0, 5 °C a -2, 5 °C por minuto, en el que la composición de virus es formulada en una solución de tampón fosfato de 5, 0 mM a aproximadamente 20 mM que comprende sales monobásicas y dibásicas de sodio y/o de potasio y que tiene un pH de aproximadamente 6, 5 a aproximadamente 7, 8; y (b) liofilizar la composición de virus, en la que la composición de virus liofilizada es estable durante al menos un año a una temperatura de almacenamiento de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 10 °C. 10

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura de transición vítrea es de aproximadamente -40 °C a aproximadamente -50 °C.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura de transición vítrea es de aproximadamente -30 °C a aproximadamente -40 °C.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la temperatura de transición vítrea de aproximadamente -35 15 °C se alcanza en un tiempo de 40 minutos o menos.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la temperatura de transición vítrea de aproximadamente -35 °C se alcanza en un tiempo de 20 minutos o menos.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la composición de virus es formulada en una solución tampón 10 mM que comprende sales monobásicas y dibásicas de sodio y/o potasio y que tiene un pH de 20 aproximadamente 6, 5 a aproximadamente 7, 8.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la composición de virus comprende además ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico de aproximadamente 0, 25 mM a aproximadamente 25 mM.

8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la composición de virus comprende además cloruro de magnesio de aproximadamente 0, 01 mM a aproximadamente 1 mM y cloruro cálcico de aproximadamente 0, 01 25 mM a aproximadamente 1 mM.

9. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la composición de virus comprende además HEPES de aproximadamente 0, 25 mM a aproximadamente 25 mM HEPES, cloruro de magnesio de aproximadamente 0, 01 mM a aproximadamente 1 mM y cloruro cálcico de aproximadamente 0, 01 mM a aproximadamente 1 mM.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la composición de virus comprende sacarosa, ácido 30 L (+) glutámico o sal monosódica de ácido L (+) glutámico o una mezcla de ácido L (+) glutámico /sal monosódica de ácido L (+) glutámico y albúmina humana (HA) .

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que HA es nativa o recombinante.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la composición de virus comprende además peptona de soja. 35

13. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la composición de virus comprende además aproximadamente 50 g/l de sacarosa, ácido L (+) -glutámico de aproximadamente 0, 049 mM a aproximadamente 2, 45 mM o la sal monosódica de ácido L (+) -glutámico de aproximadamente 0, 049 mM a aproximadamente 2, 45 mM o una mezcla de los mismos, y de aproximadamente 1, 0 g/l a aproximadamente 10, 0 g/l de HA. 40

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que de aproximadamente 1, 0 g/l a aproximadamente 10, 0 g/l de HA está sustituido por aproximadamente 50 g/l de peptona de soja.

15. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la composición de virus comprende aproximadamente 50 g/l de sacarosa, ácido L (+) -glutámico de aproximadamente 0, 049 mM a aproximadamente 2, 45 mM o la sal monosódica de ácido L (+) -glutámico de aproximadamente 0, 049 mM a aproximadamente 2, 45 mM o una 45 mezcla de los mismos, y de aproximadamente 1, 0 g/l a aproximadamente 10 g/l de HA y aproximadamente 50 g/l de peptona de soja.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la temperatura de almacenamiento es 5 °C.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la liofilización de la composición de virus en la etapa (b) comprende aproximadamente 0, 2 ml a aproximadamente 1, 0 ml de la composición de virus en un medio 50 recipiente adecuado.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el medio recipiente se define adicionalmente como un vial, un tuvo o un dispositivo de pulverización nasal.

19. El procedimiento de la reivindicación 1, definido adicionalmente como:

(a) colocar de aproximadamente 0, 5 ml a aproximadamente 0, 6 ml de la composición de virus en un vial y enfriamiento a una temperatura de aproximadamente 5 °C; 5

(b) colocar el vial en un estante de la liofilización y disminuir la temperatura del estante de 5 °C a -50 °C a una velocidad de aproximadamente -1, 0 °C por minuto a aproximadamente -2, 0 °C por minuto;

(c) mantener la temperatura del estante a aproximadamente -50 ° C durante 60 minutos;

(d) reducir la presión de la cámara a 13, 33 Pa y mantener la temperatura del estante a aproximadamente -50 ° C durant.

3. 60 minutos; 10

(e) aumentar la temperatura del estante de -50 °C a 0 °C a una velocidad de aproximadamente 1, 0 °C por minuto a aproximadamente 2, 0 °C a aproximadamente 13, 33 Pa y mantener la temperatura del estante a aproximadamente 0 °C durante aproximadamente 540 minutos hasta aproximadamente 720 minutos;

(f) aumentar la temperatura del estante de 0 °C a 15 °C a una velocidad de aproximadamente 0, 5 °C por minuto a aproximadamente 13, 33 Pa y mantener la temperatura del estante a aproximadamente 15 °C 15 durante aproximadamente 600 minutos hasta aproximadamente 720 minutos; y

(g) rellenar el vial con gas nitrógeno y sellar herméticamente el vial.

20. El procedimiento de la reivindicación 1, definido adicionalmente como:

(a) colocar de aproximadamente 0, 5 ml a aproximadamente 0, 6 ml de la composición de virus en un vial y enfriar a una temperatura de aproximadamente 5 °C; 20

(b) congelar un estante de liofilización a una temperatura de aproximadamente -70 ºC;

(c) colocar el vial en el estante de la liofilización y mantener la temperatura a aproximadamente -70 ° C durante aproximadamente 60 minutos;

(d) reducir la presión de la cámara a aproximadamente 13, 33 Pa y aumentar la temperatura del estante de-70 ° C a -50 ° C a una velocidad de aproximadamente 1, 0 ° C por minuto; 25

(e) aumentar la temperatura del estante de -50 °C a 0 °C a una velocidad de aproximadamente 1, 0 °C por minuto a aproximadamente 2, 0 °C por minuto a aproximadamente 13, 33 Pa y mantener la temperatura del estante a aproximadamente 0 °C durante aproximadamente 540 minutos hasta aproximadamente 720 minutos;

(f) aumentar la temperatura del estante de 0 °C a 15 °C a una velocidad de aproximadamente 0, 5 °C por 30 minuto a aproximadamente 13, 33 Pa y mantener la temperatura del estante a aproximadamente 15 °C durante aproximadamente 600 minutos hasta aproximadamente 720 minutos; y

(g) rellenar el vial con gas nitrógeno y sellar herméticamente el vial.