Producción de productos biofarmacéuticos a base de baculovirus sin viriones baculovíricos contaminantes.

Procedimiento para la producción de un producto biofarmacéutico,

que comprende:

(a) infectar una célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica con al menos un baculovirus, en donde dicho al menos un baculovirus comprende un genoma que codifica dicho producto biofarmacéutico, y

(b) mantener la célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica en condiciones tales que se produce el producto biofarmacéutico,

en donde el genoma de dicho al menos un baculovirus es deficiente para vp80 o en donde dicha célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica comprende un sistema de control de la expresión que permite la inactivación de vp80.

Producción de productos biofarmacéuticos a base de baculovirus sin viriones baculovíricos contaminantes La presente invención se refiere a los procedimientos para la producción de productos biofarmacéuticos por aplicación de un sistema basado en baculovirus. Estos procedimientos permiten ventajosamente la producción de productos biofarmacéuticos con poca o ninguna contaminación de viriones baculovíricos.

Durante las últimos veinte años, la tecnología de células de insecto y baculovirus se ha convertido en un sistema de expresión eucariota utilizado con mucha frecuencia para la producción de proteínas recombinantes, no sólo con propósitos científicos, sino que cada vez más para la medicina humana y veterinaria (Condreay y Kost, 2007, van Oers, 2006) . En concreto, los baculovirus recombinantes procedentes del virus de la nucleopolihedrosis múltiple de Autographa californica (AcMNPV, por su nombre en inglés) se emplean ampliamente para la producción a gran escala de proteínas heterólogas en cultivos de células de insecto. Las principales razones para la frecuente aplicación de este sistema son: (1) un nivel de expresión elevado de las proteínas foráneas, (2) las células de insecto son capaces de crecer en un cultivo de suspensión y, por lo tanto, se escalan con facilidad, (3) las proteínas sintetizadas en las células de insecto se procesan y se modifican postraduccionalmente, (4) las técnicas de manipulación están bien desarrolladas para los vectores víricos, lo que da lugar a un sistema de expresión flexible, y

(5) no es patógeno para los humanos, ya que el abanico de hospedadores de los baculovirus se limita a insectos e invertebrados. Los vectores baculovíricos recombinantes se están utilizando para la producción de proteínas individuales, por ejemplo, con el objetivo de hacer vacunas con subunidades, pero también para estructuras de orden superior que contienen una o más proteínas, tales como complejos enzimáticos, virus o partículas similivíricas.

Las partículas similivíricas (VLP, por su nombre en inglés) son estructuras muy organizadas que se autoensamblan a partir de proteínas estructurales procedentes de virus. Estas nanopartículas versátiles y estables poseen unas excelentes propiedades adyuvantes capaces de inducir las respuestas inmunitarias adquirida e innata (Ludwig y Wagner, 2007) . Durante los últimos años, las VLP se han empleado en otras ramas de la biotecnología para sacarle partido a su estabilidad estructural y a que tolera la manipulación para portar y visualizar moléculas heterólogas, o servir de bloques fundamentales para nanomateriales nuevos. Para las aplicaciones inmunoterapéuticas y preventivas, se han producido exitosamente muchos tipos de partículas similivíricas (VLP) en las células de insecto infectadas con baculovirus (Noad y Roy, 2003, van Oers et al., 2006, Ramqvist et al., 2007) . El primer logro comercial de la tecnología de las VLP de baculovirus para su uso en los humanos es la vacuna del virus del papiloma humano (HPV, por su nombre en inglés) recientemente comercializada por GlaxoSmithKline, que protege de las cepas de HPV 16 y 18. La proteína L1 de cada uno de estos tipos de HPV se expresó mediante un vector baculovírico recombinante y las VLP resultantes se combinaron para producir la vacuna CervarixTM (Harper et al., 2006) .

Hoy en día se están dedicando muchos recursos al desarrollo de partículas similivíricas de la gripe derivadas de baculovirus, así como vacunas con subunidades de la gripe, lo que constituiría una nueva generación de posibles vacunas basadas en cultivos de células que no sean de mamíferos y que no sean huevos. Las partículas similivíricas de la gripe incapaces de replicarse son eficaces a la hora de desencadenar una respuesta inmunitaria protectora, amplia, y que sirva en varios clados contra las proteínas de aislados emergentes de la gripe H5N1, lo que da lugar a un posible candidato de vacuna de la gripe pandémica para los humanos que se puede almacenar para ser usada en el caso de un brote de la gripe H5N1 (Bright et al., 2008) . Una vacuna con subunidades de la gripe producida en las células de insecto está muy cerca de la autorización de la FDA (Cox y Hollister, 2009) . En principio, se podrían aplicar estrategias parecidas para las vacunas contra la gripe pandémica, tal como el brote reciente de gripe porcina.

Con propósitos genoterápicos, la tecnología de células de insecto y baculovirus también se aplica a la producción de vectores de dependovirus (AAV, por su nombre en inglés) infecciosos (p. ej., Urabe et al., 2002) y vectores lentivíricos (Lesch et al., 2008) . Para la producción de vectores de AAV, se coinfectan las células de insecto con tres baculovirus recombinantes: uno que produce proteínas de la replicasa (REP) de los AAV, uno que lleva las funciones CAP para producir las proteínas estructurales víricas de los AAV (VP1, VP2, VP3) , y un tercer baculovirus que comprende un vector de AAV-ITR con la capacidad de portar y transferir transgenes. Recientemente se había publicado una versión mejorada para esta producción que se basa en el uso único de baculovirus recombinantes, en donde uno de ellos lleva las funciones REP y CAP de los AAV (Smith et al., 2009) . El vector de AAV que se forma es indistinguible del producido en las células de mamífero basándose en sus propiedades físicas y biológicas. El rendimiento de las partículas de vector de AAV-ITR se acercó a 5 × 104 por célula de insecto Sf9, lo que demuestra que el sistema es capaz de producir grandes cantidades de vectores de AAV de una manera sencilla. En la actualidad están en marcha ensayos clínicos con vectores de AAV procedentes de baculovirus, por ejemplo, para la deficiencia de la lipoproteína lipasa (Amsterdam Molecular Therapeutics B. V.) . Como alternativa, una estrategia escalable para producir vectores lentivíricos (Lesch et al., 2008) , en la que las células 293T de mamífero se transdujeron simultáneamente con cuatro baculovirus recombinantes producidos en las células de insecto para expresar todos los elementos que se necesitaban para la generación de un vector lentivírico seguro. El título de

lentivirus sin concentrar en el medio de cultivo de las células de mamífero era de promedio 2, 5 × 106 UT ml-1 , comparable al título de los lentivirus producidos mediante los procedimientos convencionales de transfección con cuatro plásmidos. Además, se está invirtiendo en general para convertir los procedimientos de producción de vectores lentivíricos en tecnologías basadas en células de insecto que se puedan escalar mejor.

Tjia et al., 1983, descubrieron que los BV se pueden internalizar en las células de mamíferos y que algunos de los ADN víricos incluso alcanzaron el núcleo de las células. Otros estudios demostraron que los baculovirus consiguen entrar en las células de mamífero y se ponen a expresar la cloranfenicol acetiltransferasa de Escherichia coli controlada por el promotor del virus del sarcoma de Rous (Carbonell et al., 1985) . Estos hallazgos condujeron al desarrollo de nuevos vehículos baculovíricos para introducir genes en las células de mamífero (Boyce y Bucher, 1996, Hofmann et al., 1995, Condreay y Kost, 2007, Kaikkonen et al., 2008) . Hoy en día, existen pruebas firmes de que los vectores baculovíricos para la introducción de genes son capaces de conseguir la expresión transitoria y estable de los genes foráneos en las células de mamífero después de la selección con antibióticos (Lackner et al., 2008) .

Hay todavía se sabe poco de la actividad transcripcional de los promotores de baculovirus en las células de mamíferos. Se ha demostrado que la proteína transactivadora IE1 del AcMNPV es funcional en las células de mamíferos (Murges et al., 1997) , así como el promotor de temprano a tardío (ETL, por su nombre en inglés) (Liu et al., 2006a, b) . Entre las otras áreas poco exploradas se encuentra la interacción de los baculovirus con los componentes del sistema inmunitario de los mamíferos. El AcMNPV es capaz de inducir la producción de citocinas antivíricas, lo que protege a las células de la infección por el virus de la estomatitis vesicular y por el virus de la gripe (Abe et al., 2003, Gronowski et al., 1999) . El AcMNPV también es reconocido por el receptor 9 de tipo Toll en las células dendríticas y en los macrófagos, y el AcMNPV induce inmunidad adquirida antitumoral (Kitajima y Takaku, 2008) . Estos resultados sugieren que el AcMNPV tiene el potencial de ser un virus eficaz o un agente terapéutico antitumoral que induce las inmunidades innata y adquirida. A pesar de los efectos universalmente positivos del AcMNPV sobre los componentes de la inmunidad humoral y la adaptativa mediada por células en los ratones, la... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de un producto biofarmacéutico, que comprende:

(a) infectar una célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica con al menos un baculovirus, en donde dicho al menos un baculovirus comprende un genoma que codifica dicho producto biofarmacéutico, y

(b) mantener la célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica en condiciones tales que se produce el producto biofarmacéutico,

en donde el genoma de dicho al menos un baculovirus es deficiente para vp80 o en donde dicha célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica comprende un sistema de control de la expresión que permite la inactivación de vp80.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde  vp80 se hace deficiente en dicho genoma por medio de una sustitución, inserción o deleción de nucleótidos; o  en donde la célula de insecto productora de sustancia biofarmacéutica es una célula de insecto recombinante que comprende una construcción que expresa un dsRNA específico de vp80, en donde el dsRNA se expresa opcionalmente bajo un promotor inducible.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde al menos un baculovirus se produce antes de la etapa (a) en una célula productora de baculovirus que expresa una copia que complementa la vp80.

4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la deficiencia o inactivación de vp80 no afecta a la expresión muy tardía de dicho baculovirus en comparación con la expresión muy tardía del baculovirus de tipo silvestre.

5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el producto biofarmacéutico es una proteína recombinante, un virus recombinante o una partícula similivírica.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el producto biofarmacéutico es un AAV recombinante.

7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el producto biofarmacéutico está codificado por al menos un gen introducido en el genoma baculovírico recombinante bajo el control del promotor de la polihedrina o de p10.

8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde al menos un baculovirus procede de AcMNPV o BmNPV.

9. Utilización de un sistema de células de insecto y baculovirus para la producción de un producto biofarmacéutico, en donde el sistema de células de insecto y baculovirus comprende una célula de insecto productora de baculovirus infectada con al menos un baculovirus recombinante, en donde:

 el baculovirus recombinante, o cada uno de ellos, comprende un genoma baculovírico que codifica el producto biofarmacéutico o al menos un componente del producto biofarmacéutico, y

 el genoma baculovírico recombinante, o cada uno de ellos, es deficiente para vp80, o la célula de insecto productora de baculovirus comprende un sistema de control de expresión que permite la inactivación de vp80.