Producción aumentada de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos mediante cultivos de alta densidad de microbios eucariotas en fermentadores.
Procedimiento para producir lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos a partir de microorganismos eucariotas capaces de producir por lo menos aproximadamente el 20% de su biomasa en forma de lípidos,
que comprende añadir a un medio de fermentación que comprende dichos microorganismos una fuente de carbono no alcohólica y una fuente de nutrientes limitadora en una proporción suficiente para incrementar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación hasta por lo menos aproximadamente 100 g/l.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2001/002715.
Solicitante: DSM IP ASSETS B.V..
Nacionalidad solicitante: Países Bajos.
Dirección: HET OVERLOON 1 6411 TE HEERLEN PAISES BAJOS.
Inventor/es: BARCLAY, WILLIAM, R., BAILEY, RICHARD, B., DIMASI,DON, HANSEN,JON,M, MIRRASOUL,PETER,J, WEEDER,GEORGE,T.,III, KANEKO,TATSUO, RUECKER,CRAIG,M.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A23D9/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A23 ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO, NO CUBIERTO POR OTRAS CLASES. › A23D ACEITES O GRASAS COMESTIBLES, p. ej. MARGARINAS, "SHORTENINGS", ACEITES PARA COCINAR (productos alimenticios para animales C11B, C11C; hidrogenación C11C 3/12). › Otros aceites o grasas comestibles, p. ej. aceites para cocinar.
- A23L1/03
- C12N1/00 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo.
- C12P7/64 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas.
- C12R1/89 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS. › C12R 1/00 Microorganismos. › Algas.
PDF original: ES-2208141_T1.pdf
Fragmento de la descripción:
Producción aumentada de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos por cultivos de alta densidad de microbios eucariotas en fermentadores.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para el cultivo de microorganismos y a la recuperación de lípidos microbianos. Particularmente, la presente invención se refiere a la producción de lípidos microbianos poliinsaturados.
Antecedentes de la invención
En general se ha creído que la producción de ácidos grasos polienoicos (ácidos grasos que contienen 2 o más enlaces carbono-carbono insaturados) en los microorganismos eucarióticos requería la presencia de oxígeno molecular (es decir, condiciones aeróbicas) . Esto es debido a la creencia de que el doble enlace cis de carbono formado en los ácidos grasos de todos los microorganismos eucarióticos no parasitarios implica una reacción de desaturación que depende del oxígeno (sistemas de desaturación microbianos oxidativos) . Entre otros lípidos microbianos eucarióticos que es conocido que requieren oxígeno molecular se incluyen los esteroles fúngicos y vegetales, los oxicarotenoides (es decir, las xantofilas) , las ubiquinonas y los compuestos preparados a partir de cualquiera de estos lípidos (es decir, los metabolitos secundarios) .
Se ha demostrado que determinados microbios eucarióticos (tales como algas; hongos, incluyendo la levadura; y protistas) representan buenos productores de ácidos grasos polienoicos en los fermentadores. Sin embargo, los cultivos de muy alta densidad (con biomasa microbiana superior a 100 g/l, especialmente a escala comercial) pueden conducir a contenidos reducidos de ácidos grasos polienoicos y, por lo tanto, a una productividad reducida de ácidos grasos polienoicos. Esto puede deberse, en parte, a una serie de factores, entre los que se incluyen la dificultad para mantener los niveles elevados de oxígeno disuelto, debido a la gran demanda de oxígeno desarrollada por la gran concentración de microbios en el caldo de fermentación. Entre los procedimientos utilizados para el mantenimiento del nivel elevado de oxígeno disuelto se incluyen el aumento de la velocidad de aireación y/o la utilización de oxígeno puro en vez de aire, para la aireación, y/o el incremento de la velocidad de agitación en el fermentador. Generalmente, estas soluciones incrementan el coste de la producción de los lípidos y los costes de instalación de las máquinas de fermentación, y pueden causar problemas adicionales. Por ejemplo, el incremento de la aireación puede ocasionar fácilmente serios problemas de creación de espumas en el fermentador a altas densidades celulares y un incremento del mezclado puede ocasionar la rotura de células microbianas debido al incremento de las fuerzas de cizalla en el caldo de fermentación (causando así la liberación de los lípidos en el caldo de fermentación, en el que pueden oxidarse y/o resultar degradados por enzimas) . La rotura de las células microbianas se considera un problema particularmente importante en las células que han experimentado limitación o agotamiento del nitrógeno para inducir la formación de lípidos, resultando en paredes celulares más débiles.
Como resultado, cuando se cultivan microbios eucarióticos productores de lípidos a concentraciones muy altas, sus lípidos generalmente sólo contienen cantidades reducidas de ácidos grasos polienoicos. Por ejemplo, la levadura Lipomyces starkeyi ha sido cultivada a una densidad de 153 g/l con una concentración de lípidos resultante de 83 g/l a las 140 horas, utilizando alcohol como fuente de carbono. Sin embargo, el contenido de ácidos grasos polienoicos en la levadura, a concentraciones superiores a 100 g/l, de media era de 4, 2% del total de ácidos grasos (reduciéndose desde un máximo de 11, 5% del total de ácidos grasos a una densidad celular de entre 20 y 30 g/l; Yamauchi et al., J. Ferment. Technol. 61: 275-280, 1983) . Esto resulta en una concentración de ácidos grasos polienoicos de sólo aproximadamente 3, 5 g/l y una productividad media de ácidos grasos polienoicos de sólo aproximadamente 0, 025 g/l/hr. Además, el único ácido graso polenóico descrito en los lípidos de la levadura era C18:2.
Se ha demostrado que otra levadura, Rhodotorula glutinus, presenta una productividad media de lípidos de aproximadamente 0, 49 g/l/hr, pero que además presenta un contenido muy reducido de ácidos grasos polienoicos en sus lípidos (15, 8% del total de ácidos grasos, 14, 7 de C18:2 y 1, 2% de C18:3) , resultando en una productividad de ácidos grasos polienoicos en cultivo de alimentación por lotes de aproximadamente 0, 047 g/l/hr y de 0, 077 g/l/hr en un cultivo continuo.
Uno de los presentes inventores ha demostrado anteriormente que determinadas microalgas marinas del orden traustoquitriales puede representar un productor excelente de ácidos grasos polienoicos en fermentadores, especialmente cuando se cultivan a niveles de salinidad reducidos y especialmente a niveles muy reducidos de cloruro. Otros inventores han dado a conocer que los traustoquítridos muestran una productividad media de ácidos grasos polienoicos (DHA, C22:6n-3; y DPA, C22:5n-6) de aproximadamente 0, 158 g/l/hr cuando se cultivan a una densidad celular de 59 g/l durante 120 horas. Sin embargo, esta productividad se alcanzó sólo con un valor de salinidad de 50% de la del agua marina, una concentración que causaría serias corrosiones en los fermentadores de acero inoxidable convencionales.
Los costes de producción de lípidos microbianos que contienen ácidos grasos polienoicos, en especial ácidos grasos altamente insaturados, tales como C18:4n-3, C20:4n-6, C20:5n-3, C22:5n-3, C22:5n-6 y C22:6n-3, se han mantenido altos debido, en parte, a las densidades limitadas a las que se han cultivado los microbios eucarióticos que contienen los ácidos grasos polienoicos y a la limitada disponibilidad de oxígeno tanto a estas altas concentraciones celulares como a las altas temperaturas necesarias para conseguir altas productividades.
Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento para el cultivo de microorganismos a altas concentraciones que simultáneamente permita un incremento de la producción de lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos.
La patente WO nº A-92/13.086 describe un procedimiento para la producción de un aceite que contiene ácido araquidónico sustancialmente libre de ácido eicosapentaneoico, que comprende el cultivo de una especie de Pythium que produce un aceite araquidónico sustancialmente libre de ácido eicosapentaneoico bajo condiciones adecuadas para la producción de cultivos de aceite; la recolección de dicho Pythium; la extracción de dicho aceite de dicho Pythium recolectado y la recuperación de dicho aceite.
Sumario de la invención
Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la producción de lípidos microbianos que comprende:
(a) llevar a cabo una fermentación de un medio que comprende microorganismos, una fuente de carbono y una fuente de nutriente limitante y proporcionar las condiciones suficientes para el mantenimiento de un nivel de oxígeno disuelto de por lo menos aproximadamente 4% de la saturación en dicho medio de fermentación para aumentar la densidad de biomasa;
(b) suministrar posteriormente las condiciones suficientes para el mantenimiento de un nivel de oxígeno disuelto de aproximadamente 1% o inferior de la saturación en dicho medio de fermentación y proporcionar las condiciones suficientes para permitir a dichos microorganismos la producción de dichos lípidos, y
(c) recuperar dichos lípidos microbianos.
en el que por lo menos 15% de dichos lípidos microbianos son lípidos poliinsaturados, y
en el que una densidad de biomasa de por lo menos 100g/l se alcanza durante la fermentación.
Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para el enriquecimiento del contenido de ácidos grasos polienoicos de un microorganismo, que comprende la fermentación de dicho microorganismo en un medio de cultivo que presenta un nivel de oxígeno disuelto inferior a 1% de la saturación.
Según todavía otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento heterotrófico para la producción de productos y microorganismos, que comprende el cultivo de dichos microorganismos en un medio de cultivo que presenta un nivel de oxígeno disuelto inferior a 1% de la saturación en el que dichos microorganismos presentan genes de la policétido sintasa.
Se da asimismo a conocer un procedimiento para el cultivo de microorganismos eucarióticos capaces de producir por lo menos... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para producir lípidos que contienen ácidos grasos polienoicos a partir de microorganismos eucariotas capaces de producir por lo menos aproximadamente el 20% de su biomasa en forma de lípidos, que comprende añadir a un medio de fermentación que comprende dichos microorganismos una fuente de carbono no alcohólica y una fuente de nutrientes limitadora en una proporción suficiente para incrementar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación hasta por lo menos aproximadamente 100 g/l.
2. Procedimiento para cultivar microorganismos eucariotas capaces de producir por lo menos aproximadamente el 20% de su biomasa en forma de lípidos, comprendiendo dicho procedimiento añadir a un medio de fermentación que comprende dichos microorganismos una fuente de carbono y una fuente de nutrientes limitadora en una relación suficiente para incrementar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación hasta por lo menos aproximadamente 100 g/l, en el que dicho procedimiento produce por lo menos una proporción de aproximadamente 0, 5 g/l/hora de lípidos, y en el que por lo menos aproximadamente el 15% de los lípidos totales producidos por dichos microorganismos son lípidos poliinsaturados.
3. Procedimiento para cultivar microorganismos eucariotas que comprende añadir a un medio de fermentación que comprende dichos microorganismos una fuente de carbono y una fuente de nutrientes limitadora en una proporción suficiente para incrementar la densidad de biomasa de dicho medio de fermentación hasta por lo menos aproximadamente 100 g/l, en el que se seleccionan dichos microorganismos de entre el grupo que comprende algas, hongos (incluyendo la levadura) , protistas, bacterias y mezclas de los mismos, y en el que dichos microorganismos son capaces de producir por lo menos aproximadamente el 20% de su biomasa en forma de lípidos que comprenden unos ácidos grasos polienoicos.
4. Procedimiento para producir lípidos microbianos eucariotas, que comprende:
5. Procedimiento para producir lípidos microbianos eucariotas, que comprende:
en el que por lo menos aproximadamente el 15% de dichos lípidos microbianos son lípidos poliinsaturados.
6. Procedimiento para producir lípidos microbianos eucariotas, que comprende:
en el que por lo menos aproximadamente el 15% de dichos lípidos microbianos son lípidos poliinsaturados.
7. Procedimiento para enriquecer el contenido en ácidos grasos polienoicos de un microorganismo, que comprende fermentar dicho microorganismo en un medio de cultivo que presenta un nivel de oxígeno disuelto menor del 10%.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende una fase de aumento de la densidad de biomasa y una fase de producción, en el que dicha fase de aumento de la densidad de biomasa comprende añadir dicha fuente de carbono y dicha fuente de nutrientes limitadora y dicha fase de producción comprende añadir dicha fuente de carbono sin adición o con adición reducida de dicha fuente de nutrientes limitadora, para inducir condiciones de nutrientes limitadoras que induzcan la producción de lípidos.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 ó 8, en el que la cantidad de oxígeno disuelto presente en dicho medio de fermentación durante dicha fase de producción o dicha etapa de producción de lípidos es menor que la cantidad de oxígeno disuelto presente en dicho medio de fermentación durante dicha fase de aumento de la densidad de biomasa o dicha etapa de cultivo de microorganismos.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 ó 8, en el que la cantidad de oxígeno disuelto en dicho medio de fermentación durante dicha etapa de aumento de la densidad de biomasa o dicha etapa de cultivo de microorganismos es por lo menos aproximadamente el 4%.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 ó 8, en el que la cantidad de oxígeno disuelto en dicho medio de fermentación durante dicha fase de producción o dicha etapa de producción de lípidos es menor de aproximadamente el 1%.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 5, en el que dicha fuente de carbono no alcohólica comprende un carbohidrato.
13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 ó 36, en el que dicha fuente de nutrientes limitadora se selecciona de entre el grupo que comprende fuentes de nitrógeno, fuentes de carbono, fuentes de fosfato, fuentes de vitaminas (tales como fuentes de vitamina B12, fuentes de pantotenato, fuentes de tiamina) , fuentes de oligometales (tales como fuentes de zinc, fuentes de cobre, fuentes de cobalto, fuentes de níquel, fuentes de hierro, fuentes de manganeso, fuentes de molibdeno) , y fuentes de metales mayores (tales como fuentes de magnesio, fuentes de calcio, fuentes de sodio, fuentes de potasio) , fuentes de sílice y mezclas de las mismas.
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 ó 36, en el que dicha fuente de nutrientes limitadora es una fuente de oligometales o una fuente de metales mayores seleccionada de entre el grupo que consiste en sales de sulfato y de cloruro de tales metales (tales como MgSO4}•7H
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 ó 36, en el que dicha fuente de nutrientes limitadora comprende una fuente de nitrógeno.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 ó 36, en el que dicha fuente de nutrientes limitadora comprende una sal amónica inorgánica.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 ó 36, en el que dicha fuente de nutrientes limitadora comprende hidróxido de amonio.
18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 ó 36, en el que se controla el pH del medio de fermentación por medio de dicha fuente de nutrientes limitadora.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho medio de fermentación o dicho medio de cultivo presenta una temperatura de por lo menos aproximadamente 20ºC.
20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho procedimiento produce lípidos en una proporción media de por lo menos aproximadamente 0, 5 g/l/hora.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho procedimiento produce lípidos en una proporción media de por lo menos aproximadamente 0, 5 g/l/hora y en el que por lo menos aproximadamente el 15% de dichos lípidos son lípidos poliinsaturados.
22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho procedimiento produce lípidos en una proporción media de por lo menos aproximadamente 0, 5 g/l/hora, y en el que la cantidad total de ácidos grasos omega-3 y omega-6 es por lo menos aproximadamente el 20% de dichos lípidos.
23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho procedimiento produce lípidos en una proporción media de por lo menos aproximadamente 0, 5 g/l/hora y en el que por lo menos aproximadamente el 25% de dichos lípidos es el ácido docosahexaenoico.
24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se seleccionan dichos microorganismos de entre el grupo que comprende algas, hongos (incluyendo la levadura) , protistas, bacterias y mezclas de los mismos, en el que dichos microorganismos son capaces de producir ácidos grasos polienoicos u otros lípidos que anteriormente se creía que requerían oxígeno para su síntesis.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se seleccionan dichos microorganismos de entre el grupo que comprende algas, hongos (incluyendo la levadura) , protistas, bacterias y mezclas de los mismos, en el que dichos microorganismos son capaces de producir ácidos grasos polienoicos u otros lípidos que anteriormente se creía que requerían oxígeno para su síntesis y en el que dichos microorganismos se cultivan en un procedimiento de lote alimentado.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos microorganismos se seleccionan de entre el grupo que comprende algas, hongos (incluyendo la levadura) , protistas, bacterias y mezclas de los mismos, en el que dichos microorganismos son capaces de producir ácidos grasos polienoicos u otros lípidos que anteriormente se creía que requerían oxígeno para su síntesis y en el que se cultivan dichos microorganismos en un procedimiento de lote alimentado y que comprende además mantener un nivel de oxígeno menor que aproximadamente el 3% de saturación en dicho medio de fermentación durante la fase de producción de dicho procedimiento de fermentación.
27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos microorganismos son microalgas y microorganismos a modo de algas.
28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos microorganismos son Stramenopiles.
29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos microorganismos son del orden de Traustoquitriales.
30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos microorganismos se seleccionan de entre el grupo que comprende Thraustochytrium, Schizochytrium, y mezclas de los mismos.
31. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho procedimiento además comprende:
32. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 6 ó 36, en el que dicha fuente de carbono es una fuente de carbono no alcohólica.
33. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho procedimiento produce de promedio por lo menos aproximadamente 0, 2 g/l/hora de ácido docosahexaenoico.
34. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha etapa de recuperación de lípidos comprende:
35. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha etapa de recuperación de lípidos comprende:
36. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha etapa de cultivo de microorganismos comprende añadir una fuente de carbono y una fuente de nutrientes limitadora.
37. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que dicha etapa de recuperación de lípidos comprende:
38. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que dicha etapa de recuperación de lípidos comprende:
39. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que dicha etapa de recuperación de lípidos comprende:
40. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 44, en el que dicho nivel de oxígeno disuelto es menor del 5%.
41. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 ó 44, en el que dicho nivel de oxígeno disuelto es menor del 1%.
42. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que durante una fase de cultivo inicial, el nivel de oxígeno disuelto es mayor de aproximadamente el 10% y durante una fase de producción posterior el nivel de oxígeno disuelto es menor del 10%.
43. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho microorganismo contiene genes de policeturo sintetasa.
44. Procedimiento heterótrofo para producir productos y microorganismos que comprende:
45. Procedimiento según la reivindicación 44, en el que dichos genes de policeturo sintetasa se encuentran naturalmente en dichos microorganismos.
46. Procedimiento según la reivindicación 44, en el que dichos genes de policeturo sintetasa se introducen genéticamente en dichos microorganismos.
47. Procedimiento según la reivindicación 44, en el que durante una fase de cultivo inicial, el nivel de oxígeno disuelto es mayor de aproximadamente el 10% y durante una fase de producción posterior el nivel de oxígeno disuelto es menor de aproximadamente el 10%.
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