Procedimiento de preparación de péptidos mediante el ensamblaje de múltiples fragmentos peptídicos.

Un procedimiento de preparación de un ensamblaje peptídico de n fragmentos y de n-1 aminoácidos portadores de una función tiol,

representado por la fórmula:

A1-C1-A2-C2-A3-... -Ci-1-Ai-.... -Cn-1-An (I)

en la que A1, A2, A3, ... Ai... , An son fragmentos peptídicos, C1, C2, C3... Ci-1... Cn-1 son residuos de aminoácidos portadores de una función tiol,

n está comprendido entre 3 y 50, preferentemente entre 3 y 20, 10 o entre 3 y 10, e

i es un número entero cualquiera comprendido entre 2 y n,

caracterizado por que se implementa en la preparación de un péptido-tioéster de fórmula:

A1-SR (II)

en la que A1 es un fragmento peptídico y SR es el residuo de un tioéster alquilado, pudiendo ser R un radical alquilado eventualmente sustituido,

a partir de un bis(2-sulfaniletil)amino péptido : A1-SEAoff en la que SEAoff es un grupo bis(2-sulfaniletil)amino cíclico**Fórmula**

mediante la acción de un tiol R-SH, en presencia de un agente reductor de disulfuros cíclicos, seguido de la condensación con un fragmento peptídico de estructura:

H-C1(SR')-A2-SEAoff (III)

en la que C1, A2 y SEAoff se definen como anteriormente y (SR') representa un residuo de disulfuro en el tiol del aminoácido C1, en presencia de un tiol aromático ArSH,

y después transforma el nuevo fragmento peptídico obtenido, de estructura:

A1-C1-A2-SEAoff (IV)

en la que A1, C1, A2 y SEAoff se definen como anteriormente, en un péptido-tioéster de fórmula:

A1-C1-A2-SR (II')

en la que A1, C1, A2 y R se definen como anteriormente, mediante la acción de un tiol R-SH, en presencia de un agente reductor de disulfuros cíclicos,

y se condensa con un fragmento peptídico de estructura:

H-C2(SR')-A3-SEAoff (III')

en la que SEAoff y R' y C2 y A3 se definen como anteriormente, en presencia de un tiol aromático ArSH, para proporcionar un fragmento peptídico, de estructura:

A1-C1-A2-C2-A3-SEAoff (IV')

en la que A1, C1, A2, C2, A3 y SEAoff se definen como anteriormente,

y se reiteran estas 2 operaciones hasta n-2 veces, para obtener un fragmento peptídico de estructura: A1-C1-A2-C2-A3-... -Ci-1-Ai-.... -Cn-2-An-1-SEAoff (IVm)

en la que A1, A2, A3,... Ai..., An-1, C1, C2, C3... Ci-1... Cn-2 y SEAoff se definen como anteriormente, y después se realiza una reacción de unión natural de este fragmento peptídico (IVm) obtenido, con un péptido de fórmula:

H-Cn-1-An (Vn)

en la que Cn-1 y An se definen como anteriormente, mediante una reducción en presencia de un agente reductor de disulfuros cíclicos, para proporcionar el ensamblaje peptídico múltiple de fórmula general (I).

Campo de la invención

La presente invención concierne a un procedimiento de preparación de péptidos o de polipéptidos mediante el ensamblaje de múltiples fragmentos peptídicos, utilizando la unión natural de los polipéptidos. La invención concierne igualmente a la preparación de los intermedios utilizados en este procedimiento y a dichos intermedios preparados mediante el procedimiento.

Antecedentes tecnológicos

La síntesis de polipéptidos mediante los métodos convencionales en fase sólida, de aminoácido por aminoácido, está limitada por unos bajos rendimientos cuando los polipéptidos sintetizados son de gran tamaño. Con el fin de superar esta limitación, se conoce el ensamblaje de dos polipéptidos mediante una unión química con el fin de producir un polipéptido más largo.

La síntesis total de polipéptidos es cada vez más útil para la preparación de proteínas con unas estructuras bien definidas. Los métodos de unión química aportan una respuesta a esta necesidad, no obstante parecen estar limitados en su empleo y en su aplicación industrial.

De forma general, en estos métodos se desea que la conexión entre los polipéptidos ensamblados mediante un enlace sea natural, es decir, que se corresponda con la estructura natural de polipéptidos.

El principal método de unión natural que existe hoy en día es el de Kenty Dawson, que se describe, por ejemplo, en las solicitudes internacionales WO 96/34878 yWO 98/28434. Este método se basa en una reacción quimioselectiva entre un péptido tioéster (en C terminal) y un cisteinil-péptido. No obstante, el principal inconveniente de este método es la fabricación de los péptidos tioésteres, que necesita unos procedimientos químicos complejos. Particularmente, según un modo de ensamblaje descrito por S. Kent (Kinetically Controled Ligation (KCL)), es necesaria la síntesis de los fragmentos A-SAr, H-Cys-B-SAIk y H-Cys-C. No obstante, los fragmentos de tipo A-SAr son difíciles de producir y resultan ser muy sensibles a la hidrólisis. Además, este procedimiento no permite ir más allá del ensamblaje de 3 fragmentos.

Un método alternativo es la unión denominada de Staudinger, descrita en las solicitudes internacionales WO 1/68565 y WO 1/8792. Esta comprende la reacción de un fosfinotioéster con una azida y la hidrólisis de los reactivos combinados para formar un enlace amida. No obstante, este método es difícilmente aplicable a escala industrial.

Otro método, descrito en la solicitud internacional WO 27/37812, reposa en la reacción de un a-cetoácido con una alcoxiamina en una reacción de condensación descarboxilativa. Sin embargo, los cetoácidos son unas moléculas que son difíciles de fabricar y de incorporar en los péptidos. También, este tercer método es difícilmente aplicable en los laboratorios de síntesis peptídica que no dispongan de medios para la realización de unas síntesis orgánicas complejas.

La publicación de D. Bang, B. L. Pentelute and S. B. H. Kent, Angew. Chem. Int. Ed. 26, 45, 3985 - 3988 propone una vía de síntesis que hace intervenir péptido-(tiofenilésteres) con Cys-péptido-tioésteres, y la publicación de W. Hou y coll., Org Lett., (21), 22 de diciembre de 21, propone la formación de péptidos tioésteres para la síntesis de proteínas. No obstante, estos métodos no pueden impedir la competición entre las reacciones de los diferentes tioésteres, que conducen inevitablemente a unas mezclas que pueden ser difícilmente separables, y que afectan por tanto la pureza del producto final obtenido, y a unas pérdidas inevitables de rendimiento.

Finalmente, la publicación de O. Melnyky coil., Org. Lett., 12 (22), 5238 - 41 (21) describe la unión natural de los péptidos mediante fragmentos de péptido-bis(sulfaniletil)amino. No obstante, este método no ha sido utilizado nunca, a día de hoy, para la síntesis de péptidos de múltiples fragmentos.

La transposición a escala industrial de los procedimientos que permitan la implementación de las síntesis peptídicas mediante una síntesis total es una necesidad que requiere encontrar unos procedimientos simples, poco costosos, que produzcan unos productos de calidad con una pureza elevada, y razonables con respecto a la higiene industrial.

Por las razones sindicadas anteriormente, se ha vuelto indispensable encontrar un procedimiento de síntesis total, convergente e industrializable, que permita la síntesis de una cadena peptídica de la longitud y la naturaleza deseadas. Particularmente, un procedimiento que implique un ensamblaje del N-terminal hacia el C-terminal, que ofrezca unas características de simplicidad de realización y de pureza de los péptidos o de los polipéptidos obtenidos.

Descripción de la invención

Se ha averiguado, lo que supone el objeto de la presente Invención, que el ensamblaje de múltiples fragmentos peptídicos en un método en one-pot que implica métodos simples tales como la formación de péptidos-tioésteres y la unión natural, podría conducir a un procedimiento de síntesis total, convergente, industrializable y que responda a los criterios de pureza requeridos.

Según la invención, el procedimiento de ensamblaje Implica la síntesis de péptido-tioésteres, su reacción de condensación con un péptido (o polipéptido) portador de una función bis(2-sulfaniletil)amino en un estado de disulfuro cíclico, que responde a la fórmula general:

H-C ¡-i A ¡

(IIÓ

en la que

A¡ representa un fragmento peptídico cuyo C-terminal porta un grupo bis(2-sulfaniletil)amino cíclico

/^8 N I

ws

denominado en lo sucesivo SEAoff, y

C¡.i representa un residuo de aminoácido portador de una función tiol,

así como la unión química natural en un medio productor, a nivel del C-terminal, de los pollpéptldos obtenidos.

Se entiende que el término SEAoff significa el disulfuro cíclico no reactivo, por oposición al disulfuro reactivo de estructura -N[(CH2)2-SH]2 denominado en lo sucesivo SEAon.

Se entiende que el aminoácido portador de una función tiol representado por C¡_1 puede elegirse particularmente de entre cisterna, homocisteína y que estos aminoácidos portan un residuo de disulfuro (SR) en el tiol del aminoácido, en la realización de la reacción con el péptido-tioéster.

Según la invención, el procedimiento 78conduce a la preparación de un ensamblaje peptídico múltiple que comprende residuos de aminoácidos portadores de una función tiol, es decir, un ensamblaje peptídico de n fragmentos y de n-1 aminoácidos portadores de una función tiol, representado por la fórmula:

Ai-Ci-A2-C2-A3-...- C¡-1-A¡-....- Cn-1-An (I)

en la que A-i, A2, A3,... A¡..., An son fragmentos peptídicos, C1, C2, C3... C¡_1... Cn-i son residuos de aminoácidos portadores de una función tiol, n está comprendido entre 3 y 5, preferentemente entre 3 y 2,

de una forma más preferente entre 3 y 1, e

1 es un número entero cualquiera comprendido entre 2 y n.

Se entiende que, cuando n = 3, Cn-i-An representa C2-A3 y C¡.i-A¡ representa CrA2-. En ese caso, el ensamblaje peptídico de fórmula (I) tiene la estructura: Ai-Ci-A2-C2-A3.

El procedimiento según la invención consiste en la preparación de un péptido-tioéster de fórmula:

A-i-SR (II)

en la que Ai es un fragmento peptídico y SR es el residuo de un tioéster alquilado, pudiendo ser R un radical alquilado eventualmente sustituido,

á partir de un bls(2-sulfanllet¡l)am¡no péptido A-i-SEAoff en el que SEAoff se define como anteriormente, mediante la acción de un tiol R-SH, en presencia de un agente reductor de dlsulfuros cíclicos, seguido de la condensación con un fragmento peptídico de estructura:

H-Ci(SR)-A2-SEAoff (III)

en la que C-i, A2 y SEAoff se definen como anteriormente, y (SR) representa un residuo de disulfuro en el tiol del aminoácido Ci, en presencia de un tiol aromático ArSH,

y después la transformación del nuevo fragmento peptídico obtenido, de estructura:

Ai-Ci-A2-SEAoff (IV)

en la que A-i, C-i, A2 y SEAoff se definen como anteriormente, en un péptido-tioéster de fórmula:

Ai-Ci-A2-SR (II')

en la que A-i, C1, A2 y R se definen como anteriormente, mediante la acción de un tiol R-SH, en presencia de un agente reductor de disulfuros cíclicos, seguido de la condensación con un fragmento peptídico de estructura:

H-C2(SR')-A3-SEAoff (NI')

en la que SEAoff y R' y C2 y A3 se definen como anteriormente, en presencia de un tiol aromático ArSH, para dar un fragmento peptídico, de estructura:

Ai-Ci-A2-C2-As-SEAoff

(IV)

en la que A-i,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de un ensamblaje peptídico de n fragmentos y de n-1 aminoácidos portadores de una fundón tiol, representado por la fórmula:

A1-C1-A2-C2-A3-...- C¡_1-A¡-....- Cn-1-An (I)

en la que Ai, A2, Ab,... A¡... , An son fragmentos peptídicos, C1, C2, C3... C¡_1... Cn-i son residuos de aminoácidos portadores de una función tiol,

n está comprendido entre 3 y 5, preferentemente entre 3 y 2, o entre 3 y 1, e i es un número entero cualquiera comprendido entre 2 y n,

caracterizado por que se implementa en la preparación de un péptido-tioéster de fórmula:

A1-SR (II)

en la que Ai es un fragmento peptídico y SR es el residuo de un tloéster alquilado, pudlendo ser R un radical alquilado eventualmente sustituido,

a partir de un bis(2-sulfaniletil)amino péptido : A-i-SEAoff en la que SEAoff es un grupo bls(2-sulfan¡letll)amino cíclico

N

mediante la acción de un tiol R-SH, en presencia de un agente reductor de disulfuros cíclicos, seguido de la condensación con un fragmento peptídico de estructura:

H-Ci(SR)-A2-SEAoff (III)

en la que C1, A2 y SEAoff se definen como anteriormente y (SR) representa un residuo de disulfuro en el tiol del aminoácido C1, en presencia de un tiol aromático ArSH, y después transforma el nuevo fragmento peptídico obtenido, de estructura:

Ai-Ci-A2-SEAoff (IV)

en la que Ai, C1, A2 y SEAoff se definen como anteriormente, en un péptido-tioéster de fórmula:

A1-C1-A2-SR (II)

en la que A-i, C1, A2 y R se definen como anteriormente, mediante la acción de un tiol R-SH, en presencia de un agente reductor de disulfuros cíclicos, y se condensa con un fragmento peptídico de estructura:

H-C2( S R')-A3-S E Aoff (III)

en la que SEAoff y R y C2 y A3 se definen como anteriormente, en presencia de un tiol aromático ArSH, para proporcionar un fragmento peptídico, de estructura:

A1-C1 - A2-C2-A3-S E Aoff

(IV)

en la que Ai, C1, A2, C2, A3 y SEAoff se definen como anteriormente,

y se reiteran estas 2 operaciones hasta n-2 veces, para obtener un fragmento peptídico de estructura:

A1-C1-A2-C2-A3-...- Cm-Aí-....- Cn-2-An-i-SEAoff (IVm)

en la que A-i, A2, A3,... A¡-~, An-1, C1, C2, C3... Cu... Cn-2 y SEAoff se definen como anteriormente, y después se realiza una reacción de unión natural de este fragmento peptídico (IVm) obtenido, con un péptido de fórmula:

H-Cn-1-An (Vn)

en la que Cn-i y An se definen como anteriormente, mediante una reducción en presencia de un agente reductor de disulfuros cíclicos, para proporcionar el ensamblaje peptídico múltiple de fórmula general (I).

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que se prepara un ensamblaje peptídico de 3 o de 4 fragmentos, con las estructuras A1-C1-A2-C2A3 o Ai-Ci-A2-C2-A3-C3-A4.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que se prepara un ensamblaje peptídico de 3 fragmentos en una reacción en "one pot".

4. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que C-i, C2, C3... Cn-i

representan residuos de Cys.

5. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que uno o varios de los fragmentos peptídicos A2... A¡... An-i pueden portar uno o varios aminoácidos modificados.

6. Un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la condensación del péptido- tioéster con un fragmento peptídico de estructura (III) se efectúa en presencia del ácido 4-mercaptofenilacético.

7. Procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica caracterizado por que comprende:

- la fabricación de un polipéptido o de un péptido según el procedimiento de fabricación de un polipéptido de fórmula (I) según una de las reivindicaciones 1 a 5, y

- la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido o un péptido así preparado, en estado puro o en asociación con uno o con varios coadyuvantes compatibles y farmacéuticamente aceptables.

8. Un procedimiento de fabricación de un dispositivo de diagnóstico caracterizado por que comprende:

- la fabricación de un polipéptido o de un péptido según el procedimiento de fabricación de un polipéptido de fórmula (I) según una de las reivindicaciones 1 a 5, y

- la formulación o la preparación de este polipéptido en una forma adaptada para una utilización para un dispositivo de diagnóstico.