Nuevos mutantes de proNGF y usos de los mismos en la producción de beta-NGF.

Un mutante de proNGF en el que el sitio de disociación con proteasas R1SK3R4 está sustituido en las posiciones R1 y K3,

correspondientes a las posiciones 101 y 103 de la secuencia de un proNGF de tipo silvestre humano (SEQ ID NO: 1), por valina en la posición 101 y por alanina en la posición 103.

dei invento

Mufanfes de pro/VGF de/ /nvenfo

En una primera forma de realización del Invento, el presente Invento proporciona un mutante de proNGF en el que el sitio de disociación con proteasas R^SK^R" está sustituido por lo menos en las posiciones R^ y correspondiendo a 15 las posiciones 101 y 103 de la secuencia de un proNGF de tipo silvestre humano (SEQ ID NO: 1) por vallna en la posición 101 y por alanlna en la posición 103.

La serlna (Ser) está apareciendo de modo natural en la posición 102 de la secuencia de un proNGF humano de tipo silvestre. X en la posición 102 (SEQ ID NO: 8) se selecciona de manera preferible entre serlna (Ser), que está apareciendo de modo natural en la posición 102 de la secuencia de un proNGF humano, pero también se puede 20 seleccionar entre cualquier otro aminoácido, en donde el aminoácido debe de ser un aminoácido de carácter no básico (es decir no es arglnlna ni Usina). Es Importante que el aminoácido en la posición 102 sea un aminoácido de carácter no básico (es decir que no sea Arg o Lys).

El aminoácido en la posición 104 de la secuencia de un proNGF humano de tipo silvestre es arginina (Arg) que está apareciendo de modo natural en la posición 104 de la secuencia de un proNGF humano.

25 El presente Invento está dirigido también a unos ácidos nucleicos que codifican los mutantes de proNGF que describen aquí de Igual manera.

Método de preparar un befa-/VGF humano a parf/r de un mu/an/e de pro/VGF de/ /nven/o

En un segundo aspecto, el presente Invento se dirige a un método de preparar un beta-NGF humano biológicamente activo a partir de un mutante de proNGF ¡nsoluble inactivo de acuerdo con el invento.

30 Preferiblemente, el mutante de proNGF se obtiene mediante una expresión recombinante en células procarióticas. Unas apropiadas cepas bacterianas son bien conocidas en la especialidad, p.ej. las de F. co//, Bac///us sp., y Sa/mone//a, y están disponibles comercialmente unos estuches para estos sistemas de expresión. Las células anfltrlonas preferidas para la expresión recombinante, son F. co//, por ejemplo E. co// BL21, JM 108/109 (K12), JM106, JM83 y TB1 y derivados de las mismas. Se podría usar cualquier otra cepa de E. co// que fuese apropiada 35 para la expresión de proteínas recombinantes.

Unos pollnucleótldos son engarzados operativamente a unas secuencias de control de la expresión que permiten la expresión de las proteínas de fusión del invento en unas células anfitrionas procarióticas. Dichas secuencias de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles y no inducibles, operadores, represores y otros elementos que son conocidos por los expertos en la especialidad y que impulsan o regulan de otro modo la 40 expresión de genes. Dichos elementos reguladores incluyen, por ejemplo, los promotores de T7, TAC, PBAD, LAC, Lacl y los represores, Lacl°

La secuencia del mutante de proNGF es introducida en la célula anfitriona procariótica por medio de un apropiado vector. Unos apropiados vectores podrían ser por ejemplo, pero sin limitarse a: pBR322, pMAL, pUC19 y todos los derivados. La célula anfitriona procariótica incluye, pero no está limitada a, unas células procarióticas, tales como 45 unas bacterias (por ejemplo, F. co// o B. subM/s), que pueden ser transformadas, por ejemplo, con un ADN plasmídico, un ADN recombinante o unos vectores de expresión de DNA cósmidos que contienen las moléculas de pollnucleótidos del presente invento. En una forma de realización del invento, se usan unos vectores plasmídicos. Por ejemplo, pero sin quedar limitado de ninguna de las maneras a ellos, se pueden usar unos vectores plasmídicos que se describen en el documento de patente europea EP1697523B1.

Con

el fin de expresar unas muteínas de proNGF, se usa un vector de expresión que contiene

a. un promotor fuerte para una transcripción directa (p.ej. un promotor de tac o T7)

b. una secuencia de codificación para un proNGF o una muteína de proNGF

c. un termlnador de la transcrlpclón/traducclón (p.ej. el termlnador tO del bacteriófago lambda)

d. un primer gen marcador selecclonable, p.ej. un gen que codifica una resistencia a antibióticos (p.ej. una resistencia a kanamlclna, kan)

e. un segundo gen marcador selecclonable, p.ej. un gen que codifica proB y/o proA

f. un gen represor (p.ej. un gen de lacl)

g. un origen de repllcaclón con alto número de coplas.

10 En una forma de realización del Invento, se pueden usar para la clonación unos vectores de expresión de propietario ((Scll Protelns GmbFI, véase el documento EP1697523B1 acerca de la estructura de un apropiado vector de expresión o unos vectores comercialmente disponibles. En lo que se refiere a una Información general acerca de los vectores que se pueden usar en el método del presente Invento se hace referencia a los detalles más arriba mencionados. No obstante, se pueden usar cualesquiera vectores apropiados que sean conocidos en la 15 especialidad.

La estructura del vector de expresión de propietario pSCIL101, como un ejemplo de un apropiado vector para la transformación de unas células anfltrlonas procarlótlcas, se describe seguidamente:

promotor de tac

20 El método para la preparación de un mutante de proNGF de acuerdo con el presente invento comprende las siguientes etapas Iniciales:

I. preparar un ácido nucleico que codifica una muteína de proNGF de acuerdo con el presente invento ¡i. introducir dicho ácido nucleico en un vector de expresión procariótico; i¡¡. introducir dicho vector de expresión en una célula anfltrlona;

25 ¡v. cultivar la célula anfltrlona;

v. someter a la célula anfltrlona a unas apropiadas condiciones de cultivación.

Debido a su expresión en unas células anfltrlonas procarlótlcas, la muteína de proNGF está en la forma de su forma ¡nsoluble Inactiva.

En una forma de realización preferida, el método de producción de un beta-NGF a partir de un mutante de proNGF 30 de acuerdo con el Invento comprende las etapas de:

a. disolver el mutante de proNGF de acuerdo con el presente Invento por solublllzaclón de unos cuerpos de Inclusión en una solución desnaturalizante;

b. transferir el mutante de proNGF a una solución de replegamlento en donde el proNGF desnaturalizado adopta una conformación biológicamente activa;

c. purificar el mutante de proNGF con respecto de la solución de replegamlento;

d. disociar la pro-secuencia del mutante de proNGF para obtener el beta-NGF activo.

En lo sucesivo, se describen las etapas sucesivas de un método para producir un beta-NGF a partir de un mutante de proNGF de acuerdo con el presente Invento.

Sapa a. So/uó/7/zac/ó/i de un mufanfe de pro/VGF

La Etapa a) corresponde a la disolución del muíante de proNGF que está sustituido junto al sitio de disociación con proteasas nativo R^SK^R" en las posiciones R^ y que corresponden a las posiciones 101 y 103 de la secuencia de un proNGF de tipo silvestre humano (SEQ ID NO: 1) por valina en la posición 101 y por alanina en la posición 103 mediante la solubilización de unos cuerpos de inclusión en una solución desnaturalizante. Se hace observar que el muíante de proNGF del invento en la etapa a) está usualmente en la forma de su forma insoluble inactiva debido a su expresión en células anfitrionas procarióticas. Un proNGF inactivo que muestra una mala solubilidad, se forma durante una sobreexpresión de la proteína en el citosol de procariotas. En este caso, el proNGF que ha sido preparado por recombinación permanece en el citoplasma en una forma insoluble y conglomerada. Estos conglomerados de proteínas, el aislamiento de los mismos, así como su purificación, se describen por ejemplo en la cita de Marston, F. A., Biochem. J. 240 (1986).

Para aislar estos conglomerados proteínicos inactivos (cuerpos de inclusión), las células procarióticas son rotas mediante una fermentación. Una rotura de las células se puede realizar mediante unos métodos convencionales, p.ej. por medio de una homogeneización a alta presión, una sonificación (= tratamiento con ultrasonidos) o un tratamiento con una lisozima (véase la cita de Rudolph, R., y colaboradores (1997); Folding proteins (proteínas de plegamiento). En: Creighton, T. E. (coordinador de edición): Protein Function: A Practical Approach [Función de proteínas, un enfoque práctico]. Oxford University Press, páginas 57-99).

Además, los cuerpos de inclusión son solubilizados. Los cuerpos de inclusión (IB = acrónimo de inclusión bodies) son unas acumulaciones de proteínas usualmente defectuosas o plegadas Incompletamente. Ellos... [Seguir leyendo]

1. Un muíante de proNGF en el que el sitio de disociación con proteasas R^SK^R" está sustituido en las posiciones R^ y K^, correspondientes a las posiciones 101 y 103 de la secuencia de un proNGF de tipo silvestre humano (SEQ ID NO: 1), por valina en la posición 101 y poralanina en la posición 103.

2. El muíante de proNGF de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el muíante se obtiene por una expresión recombinante en células procarióticas, de manera preferible por una expresión recombinante en E co//.

3. Un método de preparar un beta-NGF humano biológicamente activo que comprende (i) proporcionar un muíante de proNGF de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, y (¡i) disociar el muíante de proNGF con el fin de obtener un beta-NGF humano activo.

4. El método de la reivindicación 3, que comprende las etapas de;

a. disolver el muíante de proNGF de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 por solubilización de unos cuerpos de inclusión en una solución desnaturalizante;

b. transferir el muíante de proNGF a una solución de replegamiento en donde el proNGF desnaturalizado adopta una conformación biológicamente activa;

c. purificar la muteína de proNGF replegada;

d. disociar la pro-secuencia del muíante de proNGF para obtener el beta-NGF activo.

5. El método de la reivindicación 4,

en el que la solución desnaturalizante comprende una solución que contiene (i) una sustancia caotrópica, (¡i) un agente quelante, (i¡¡) un tampón, y (iv) un agente reductor, preferiblemente en el que la solución desnaturalizante comprende i. 1 - 8 M, de guanidinio-HCI preferiblemente 4-6 M,

¡i. 0,01 -1 M de Tris,

iii. 1 - 50 mM de EDTA,

iv. 1-100 mM seleccionados entre glutatión (GSH) o cisterna

v. pH 7,0-10,0.

y más preferiblemente comprende i. 4 M de guanidinio-HCI,

¡i. 0,1 M de Tris, i¡¡. 10 mM de EDTA

iv. 5 mM de GSH o cisterna

v. pH 8,0, o

en el que la solución de replegamiento comprende i. 0,5-1,0Mdeunachaperona,

¡i. 1-10 mM de un agente quelante de metales,

i¡¡. 0,1 -10 mM de una solución de un sistema de barajadura redox,

iv. pHde8,0-pH11,0,

preferiblemente en que la solución de replegamiento comprende i. 0,75 M de arginina,

¡i. 5 mM de EDTA

i¡¡. 1 mM de L-cistina y 5 mM de L-cisteína, o 1 mM de GSSG (glutatión oxidado) y 5 mM de GSH (glutatión reducido), iv. pH de 9,5.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 en el que el replegamiento se lleva a cabo como una renaturalización por impulsos, preferiblemente en el que en relación con el volumen de replegamiento final durante la renaturalización por impulsos, la concentración de guanidinio HCI no excede de 0,3 M y la concentración de proteína por impulsos no deberá exceder de 50 pg/ml.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que el muíante de proNGF es purificado mediante una cromatografía de modalidad mixta,

en el que la columna cromatográfica es preferiblemente una columna de un material de modalidad mixta con un ligando de afinidad sintético, más preferiblemente una columna con 4-mercapto-etil-piridina (MEP), hexilamino (HEA), fenilpropilamino (PPA), ácido 2-mercapto-5-bencimidazol sulfo ácido (MBI), Capto MMC (GEHC), N-bencil-N- metil etanolamina (GEHC), CHT hidroxiapatito o CHT fluoroapatito, de manera sumamente preferida 4-mercapto-etil- piridina (MEP).

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 4-7, en el que la pro-forma del muíante de proNGF es disociada por una proteasa, de manera preferible por una serina proteasa, de manera más preferible por tripsina.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la relación de la tripsina al mutante de proNGF es de 1 : 200 - 1 : 100.000, de manera preferible es de 1 : 5.000 - 1 : 20.000, y de manera más preferible es de 1 : 10.000 (p/p).

10. El método de las reivindicaciones 4 hasta 9 que comprende además una etapa adicional de purificar un beta- 5 NGF, de manera preferible por cromatografía en columna, de manera más preferible por medio de una columna con

SP Sepharose HP.

11. El uso de un mutante de proNGF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para producir un beta-NGF humano.