Nuevo agente estabilizante para proteínas farmacéuticas.

Un procedimiento para estabilizar una proteína de plasma de sangre humana con un peso molecular >10 kDa al añadir melezitosa a una solución que comprende la proteína de plasma de sangre humana con un peso molecular >10 kDa que es una proteína de plasma de sangre humana farmacéutica o biológicamente relevante o una proteína de plasma de sangre humana producida de manera recombinante seleccionada entre el grupo que consiste en FIX, FVIII o HES-G-CSF.

Nuevo agente estabilizante para proteínas farmacéuticas La invención se refiere a un procedimiento para estabilizar una proteína de sangre humana o una proteína plasmática con un peso molecular de > 10 kDa, una composición en estado sólido o líquido de proteína de sangre humana con un peso molecular de > 10 kDa y el uso de melezitosa para la estabilización de una proteína de sangre humana o una proteína plasmática de sangre humana.

La estabilización de proteínas terapéuticas es un estímulo principal para los científicos de formulaciones en la industria farmacéutica actual. Existen muchos tipos de tensiones que pueden producir cambios reversibles e irreversibles en las proteínas, tales como la agregación, precipitación o desnaturalización. Estas dificultades reclaman la necesidad de agentes que estabilicen estas delicadas proteínas. El desarrollo de formulaciones es una etapa crítica, que requiere una selección cuidadosa de excipientes que proporcionen un elevado rendimiento de la actividad de proteínas durante el procedimiento de purificación así como durante el procedimiento farmacéutico y como producto final. En particular, esto es cierto para las proteínas de la sangre humana y las proteínas plasmáticas de sangre humana.

Uno de los estabilizantes más ampliamente usados para las formulaciones de proteínas son los hidratos de carbono, denominados también sacáridos. Los hidratos se desarrollan a partir de componentes de hidratos de carbono básicos unidos denominados monosacáridos, y pueden ser de diferente longitud y pueden tener por tanto diferentes características.

Sacarosa y trehalosa, los dos estabilizantes más comúnmente usados, son ambos disacáridos, compuestos por tanto por dos monosacáridos.

En comparación con los dos estabilizantes de hidratos de carbono más comúnmente utilizados, sacarosa y trehalosa, que son disacáridos, melezitosa es un trisacárido. Se ha indicado generalmente [Wang W, Lyophilisation and development of solid protein pharmaceuticals, Int J Pharm 203, 1-60, 2000; Carpenter J.F., Chang B.S., Garzon-Rodriguez W., Randolph T.W., Rational design of stable lyophilized protein formulations: Theor y and practice, capítulo 5, ed Carpenter and Manning, Kluiwer Academic / Plenum Publishers, Nueva York, 2002] que los disacáridos son la primera elección para estabilizar proteínas, tanto en solución como en estado liofilizado. Algunos disacáridos, tales como lactosa o maltosa, son azúcares reductores que pueden degradar proteínas mediante la reacción de Maillard durante el almacenamiento en el estado sólido. Si se utilizan sacáridos más grandes como estabilizantes en preparaciones liofilizadas, la bibliografía sugiere que son menos eficaces debido al impedimento estérico de la interacción proteína-estabilizante [Carpenter J.F., Chang B.S., Garzon-Rodriguez W., Randolph T.W., Rational design of stable lyophilized protein formulations: Theor y and practice, capítulo 5, ed Carpenter and Manning, Kluiwer Academic / Plenum Publishers, Nueva York, 2002].

El artículo de revisión Wang, W., International Journal of Pharmaceutics, 203 (2000) 1 -60, "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals", describe, entre otros, que maltosa, glucosa y maltotriosa podrían aumentar la recuperación de la actividad catalasa en 1 mg·ml-1, pero maltopentosa, maltohexosa, y maltoheptosa no fueron tan eficaces. La ineficacia de los sacáridos más grandes sugiere que la estabilización de la proteína por azúcares puede depender de la longitud de la cadena secundaria de glucósidos del azúcar que puede interferir con el enlace de hidrógeno intermolecular entre azúcares y proteínas estabilizantes. Este artículo de revisión recomienda disacáridos como estabilizantes (p.9/10) .

El documento WO-A-2003/086443 describe el uso de hidratos de carbono que incluyen estaquiosa, melezitosa, y diversos monosacáridos y disacáridos para la preparación de preparaciones de polipéptidos administrables por vía intranasal. Los azúcares sirven como agentes para reducir los efectos de la tensión de cizalladura durante la pulverización.

El documento WO-A-86/04486 describe la purificación cromatográfica de, entre otros, el factor VIII en el que se usa melezitosa como aditivo de hidratación durante el procedimiento cromatográfico.

El documento WO-A-91/18091 describe un procedimiento de preservar sustancias biológicas o compuestos orgánicos delicados (a) en un estado seco y/o (b) a temperaturas elevadas y/o (c) bajo irradiación, que comprende incorporar a un sistema que contiene dichas sustancias o compuestos, un azúcar o un derivado de azúcar seleccionado entre (i) un glucósido no reductor de un compuesto polihidroxi seleccionado entre alcoholes azucarados y otros polialcoholes de cadena lineal, o (ii) un oligosacárido no reductor seleccionado entre rafinosa, estaquiosa y melezitosa.

Mollmann, S. H. y col informan en Drug Dev. Ind. Pharm. Julio de 2006; (6) : 765-78 acerca de la estabilidad de la insulina en formulaciones sólidas que contienen melezitosa y almidón.

La presente invención proporciona un procedimiento para estabilizar una proteína de sangre humana con un peso molecular de > 10 kDa añadiendo melezitosa a una solución que comprende la proteína de sangre humana o la proteína plasmática de sangre humana con un peso molecular de > 10 kDa.

Preferentemente, la proteína de sangre humana o la proteína plasmática de sangre humana tienen un peso molecular de > 10 kDa. Más preferentemente, el peso molecular está en el intervalo de 10 kDa a 300 kDa. Lo más preferente, el peso molecular está en el intervalo de 20 kDa a 200 kDa. Puede ser ventajoso que la proteína de sangre humana o la proteína plasmática de sangre humana tengan un intervalo de pesos moleculares de 50 kDa a 100 kDa o un intervalo de pesos moleculares de 100 kDa a 150 kDa o un intervalo de pesos moleculares de 150 kDa a 200 kDa.

En particular, la proteína de sangre humana o la proteína plasmática de sangre humana con un peso molecular de > 10 kDa es una proteína farmacéutica o biológicamente relevante. La proteína de sangre humana o la proteína plasmática de sangre humana con un peso molecular de > 10 kDa farmacéutica o biológicamente relevante que se puede estabilizar de acuerdo con la invención pueden ser una proteína de sangre humana o una proteína plasmática de sangre humana producida de manera recombinante.

El término "proteína" incluye proteínas sintetizadas químicamente así como proteínas sintetizadas naturalmente que están codificadas por genes de células cultivadas así como proteínas recombinantes secretadas por células. Las proteínas recombinantes son aquellas que están codificadas por transgenes introducidos en las células mediante técnicas de biología molecular. Las proteínas pueden modificarse mediante procedimientos químicos o mediante enzimas en procedimientos posteriores a la traducción.

De acuerdo con la invención, "proteína" incluye proteínas de seres humanos, en particular, aquellas producidas mediante cultivos celulares, pero también proteínas de otras fuentes tales como plantas, insectos, etc., y proteínas mutadas, artificiales, sintéticas, de fusión o quiméricas.

El término "proteína de sangre humana o proteína plasmática de sangre humana con un peso molecular de > 10 kDa" incluye en particular factores de coagulación de sangre humana incluyendo fibrinógeno, monómero de fibrina, protrombina, trombina, FV, FVa, FX, FXa, FIX, FIXa, FVII, FVIIa, FVIII, FXI, FXIa, FXII, FXIIa, FXIII, FXIIIa, factor de von Willebrand, ADAMTS13 etc., proteínas de transporte tales como albúmina, transferrina, ceruplasmina, haptoglobina, hemoglobina, hemopexina, etc., inhibidores de la proteasa tales como ß-antitrombina, -antitrombina, 2-macroglobulina, inhibidor-Cl, inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) , cofactor II de la heparina, inhibidor de la proteína C (PAI-3) , Proteína C, Proteína S, Proteína Z, etc., inmunoglobulinas tales como anticuerpos policlonales (IgG) , anticuerpos monoclonales, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgAl, IgA2, IgM, IgE, IgD, proteína de Bence Jones etc., proteínas plasmáticas relacionadas con células tales como fibronectina, tromboglobulina, factor 4 plaquetario, etc., apolipoproteinas tales como apo A-I, apo A-II, apo E, factores del complemento tales como Factor B, Factor D, Factor H, Factor I, inactivador de C3b, properdina, proteína de unión a C4 etc., factores de crecimiento de tipo factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor alfa de crecimiento transformante (TGF-) , factor beta de crecimiento transformante (TGF-ß) , factor de crecimiento de fibroblastos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para estabilizar una proteína de plasma de sangre humana con un peso molecular > 10 kDa al añadir melezitosa a una solución que comprende la proteína de plasma de sangre humana con un peso molecular > 10 kDa que es una proteína de plasma de sangre humana farmacéutica o biológicamente relevante o una proteína de plasma de sangre humana producida de manera recombinante seleccionada entre el grupo que consiste en FIX, FVIII o HES-G-CSF.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la solución se transfiere al estado sólido opcionalmente mediante liofilización.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en el que melezitosa está presente en una cantidad de hasta 1.000 mM, particularmente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 200 mM, en particular de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que está presente al menos un agente tensioactivo, tal como albúmina recombinante, Polysorbate 80, Polysorbate 20 o poloxámeros, en particular Poloxamer 188.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que al menos un agente tamponante está presente tal como histidina, citrato de sodio, HEPES, Tris, MOPS o PIPES.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que está presente al menos un estabilizador adicional tal como azúcares, aminoácidos, polioles, cofactores o sus combinaciones y/o en el que está presente al menos un modificador de la tonicidad, tal como cloruro de sodio, arginina, glicina, cloruro de potasio, azúcares o alcoholes de azucar y/o en el que está presente al menos un agente de volumen, tal como glicina, manitol, cloruro de sodio, arginina o sacarosa.

7. Una composición que comprende una proteína de plasma de sangre humana con un peso molecular > 10 kDa y melezitosa, y en el que la proteína es factor VIII, factor IX o HES-G-CSF.

8. La composición de la reivindicación 7 en estado líquido o sólido.

9. La composición de la reivindicación 7 u 8 que comprende adicionalmente un agente de volumen, un tensioactivo, un agente tamponante, un estabilizante adicional y/o un modificador de la tonicidad.

10. Uso de melezitosa para la estabilización de una proteína de plasma de sangre humana con un peso molecular > 10 kDa y en el que la proteína es factor VIII, factor IX o HES-G-CSF, en particular en la estabilización durante el procesamiento, en un procedimiento de liofilización, en solución, durante la purificación, y en la producción particular en un cultivo celular; o para la estabilización a largo plazo en particular para mejorar la vida útil, en el que el largo plazo son al menos 6 meses, en particular al menos 12 meses, más en particular al menos 18 meses, más particularmente 24 meses o 36 meses.