Moléculas modulares de transporte de antígenos (moléculas MAT) para la modulación de reacciones inmunitarias, constructos, métodos y usos correspondientes.

Uso de una molécula modular de transporte de antígenos (molécula MAT) - formada por al menos un módulo de translocación que promueve el transporte de la molécula MAT desde el espacio extracelular hacia el interior de la célula,

al menos un módulo de selección de dianas que promueve el transporte intracelular de la molécula MAT a los orgánulos involucrados en el procesamiento de antígenos o en la carga de moléculas MHC II con antígenos y al menos un módulo de antígeno que como mínimo es una unidad de la molécula que consta de un antígeno y que determina la especificidad de una respuesta inmunitaria en un sujeto modulada por la molécula MAT - para elaborar un medicamento destinado a la profilaxis o al tratamiento de una enfermedad infecciosa, de una enfermedad autoinmune, de una alergia, de una enfermedad reumática, de una reacción de rechazo a un órgano trasplantado y/ de una enfermedad maligna.

Moléculas modulares de transporte de antígenos (moléculas MAT) para la modulación de reacciones ¡nmunltarlas, constructos, métodos y usos correspondientes

Ámbito técnico de la presente Invención

La presente Invención se refiere a la estimulación e Inhibición del sistema ¡nmunltarlo para la profilaxis, la terapia o el diagnóstico de enfermedades acompañadas de un sistema ¡nmunltarlo no muy fuertemente estimulado o demasiado estimulado. Entre estas enfermedades cabe citar Infecciones, tumoraclones, alergias, enfermedades autolnmunes, reacciones de rechazo a trasplantes, etc. El núcleo de la presente Invención es un nuevo método que consiste en administrar una molécula MAT que Influye en el sistema ¡nmunltarlo y que consta al menos de los tres componentes siguientes:

1. un módulo de translocación que hace que la molécula MAT pueda penetrar en las células desde el exterior,

2. un módulo de selección como diana ¡ntracelular, que hace que la molécula MAT se procese en el Interior de la célula, produciendo una respuesta ¡nmunitarla modificada o una presentación modificada del antígeno, y

3. un módulo de antígeno, que determina la especificidad de la respuesta ¡nmunitarla modulada.

La combinación de estos tres elementos en una molécula MAT permite la modulación selectiva y específica del sistema ¡nmunltarlo del Individuo tratado o bien una presentación modificada del antígeno mediante la célula que presenta antígenos.

Estado técnico

Procesamiento de antígenos mediante células que presentan antígenos

El procesamiento de antígenos mediante células que presentan antígenos (APC) tiene lugar a través de dos vías diferentes. Los antígenos que aparecen ¡ntracelularmente son presentados en la superficie celular por moléculas MHC I (Major Histocompatibility Complex class I, MHC class I [comp/e/o pr/nc/pa/ de /r/sfocompaf/M/dad c/ase /]), mientras que los antígenos extracelulares son presentados en la superficie celular a través de moléculas MHC II (Major Histocompatibility Complex class II, MHC class II [comp/e/o pnnc/pa/ de /r/sfocompaf/M/dad c/ase ///). Ambos mecanismos ¡nielan una reacción inmunitaria del huésped al antígeno. El camino que toma el antígeno desde su absorción en la célula hasta la presentación en la superficie celular, en forma de un complejo MHCII-antígeno, transcurre a través de diferentes orgánulos celulares, entre otros a través del retículo endoplásmico, del aparato de Golgl, de la red trans-Golgi, de lisosomas, endosomas, y a través de "compartimentos de MHC de clase II" (MHC). En el caso de la presentación de antígenos mediada por MHC II los MHC juegan un papel importante. En estos orgánulos de la célula las moléculas de MHC II se cargan de antígenos de bajo peso molecular o de fragmentos proteolíticos de proteínas. En este proceso la "cadena invariante" (también llamada cadena gamma de MHC II o l¡), unida al principio a la molécula MHC II, se degrada proteolíticamente y bajo la regulación de diferentes proteínas, que se unen de manera directa o indirectamente a MHC II, el antígeno se une a la molécula MHC II [1]. Entre estas moléculas reguladoras se hallan HLA-DM, HLA-DO, LAMP-1, LAMP-2, CD63, CD83, etc. Hasta la fecha la función exacta de estas proteínas está en parte por aclarar, pero muchas de ellas presentan secuencias señalizadoras que promueven su transporte hacia los lisosomas, los endosomas, la red trans-Golgi, los MHC, etc. [2-4]. En el caso de las reacciones proteolíticas - necesarias para presentar el antígeno en las moléculas de MHC II - interviene una serie de proteasas. A las proteasas presentes en los MHC pertenecen, entre otros, diferentes miembros de la familia de la catepsinas, tales como p.ej. la catepsina S y la catepsina L [1].

Selección de dianas y secuencias de acceso

Las secuencias de aminoácidos que tienen la propiedad de acumularse selectivamente en un sitio interior o exterior de una célula o en un orgánulo celular determinado se denominan con frecuencia secuencias de acceso. A este respecto cabe destacar que pueden distinguirse diferentes tipos de selección de dianas. En concreto se distingue entre selección de dianas intracelulares y extracelulares. Para la selección de dianas extracelulares se usan p.ej. anticuerpos que se unen desde fuera a estructuras directamente accesibles en la superficie celular, p.ej. a la parte extracelular de proteínas de membrana. Un anticuerpo que fije una proteína a la superficie celular de células tumorales se puede acoplar p.ej. a una citotoxina. Entonces este anticuerpo hace que la citotoxina se dirija hacia la célula tumoral como diana extracelular, con lo cual ésta puede destruirse selectivamente. Este tipo de selección de dianas es básicamente distinto de la selección de dianas intracelulares, en la cual deben superarse con frecuencia membranas intracelulares o en la cual la secuencia de acceso es fijada por receptores intracelulares y así penetra p.ej. en determinados orgánulos celulares, o en la cual la secuencia de acceso puede penetrar a través de canales especiales, formados por proteínas especiales, en el orgánulo celular del cual es específica. En lo sucesivo, cuando en la presente solicitud de patente se habla de una secuencia de acceso o de un módulo de selección de dianas se refiere casi siempre a selección de dianas intracelulares y no extracelulares. Además, en la presente solicitud de patente la selección de dianas intracelulares no se refiere a cualquier tipo de diana ¡ntracelular, sino solo a las que sirven para transportar moléculas hacia orgánulos o regiones intracelulares que intervienen en la preparación, procesamiento y/o unión de antígenos a moléculas de MHC. Estos orgánulos o regiones intracelulares son p.ej. el

retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, la red trans-Golgi, endosomas, lisosomas y MIIC. Las secuencias de acceso derivadas de distintas proteínas están descritas en la literatura [1-5].

Translocación y secuencias de translocación

Asimismo se conocen de la literatura numerosas secuencias de aminoácidos, derivadas en concreto de virus, p.ej. VIH-Tat o la proteína VP22 procedente del virus del herpes simple, que facilitan el transporte de proteínas, péptidos y otras clases de sustancias, como por ejemplo ácidos nucleicos o sustancias farmacéuticamente activas, hacia el interior de la célula. Para ello estas secuencias, llamadas translocadoras, se unen mediante enlaces covalentes o no covalentes a las moléculas que deben transportarse (también llamadas moléculas de carga). Luego los compuestos resultantes de la unión de la secuencia translocadora a la molécula de carga pueden añadirse extracelularmente a las células. Después la secuencia de translocación hace llegar la molécula transportada al interior de la célula. Este principio está igualmente descrito en numerosos trabajos, especialmente para la secuencia de VIH-Tat [6-8].

Aunque era posible y estaba previsto usar un antígeno como molécula de carga, con la única ayuda de los agentes de translocación conocidos aún no se podía generar una respuesta inmunitaria tan selectiva y dosificada en un individuo como sería deseable para determinados fines - por ejemplo la desensibilización de alergias. Por lo tanto hacen falta otros procedimientos para conseguir una modulación inmunitaria selectiva.

Von Bergen J. y otros, Immunol. Rev., 1999, 172, 87-96, resumen los conocimientos hasta el año 1999 en el campo de la selección de antígenos dirigidos contra dianas. Según este artículo, para la selección de antígenos dirigidos a las moléculas MHC II se siguen dos estrategias diferentes: el uso de constructos de ADN y la absorción selectiva de antígenos, mediante receptores, por células APC que expresan los receptores correspondientes.

Sheldon K. y otros, Proc. Nati. Acad. Science U S A., 1995, 92 (6), 2056-2060, se refieren al uso de loligómeros. Las moléculas ahí descritas permiten una importación de determinadas secuencias desde la zona extracelular hacia el núcleo de la célula.

Objeto de la presente invención

Por tanto la presente invención tiene por objeto proporcionar agentes para llevar selectivamente cualquier tipo de antígenos muy diversos a su lugar de procesamiento, del modo que sea más aprovechable con fines diagnósticos y terapéuticos.

Solución del problema

La presente invención ofrece el uso de moléculas transportadoras de antígenos que permiten dirigir antígenos hacia las células de manera muy selectiva, para conseguir una reacción inmunitaria eficiente y específica. En primer lugar estas moléculas permiten el transporte eficiente de antígenos desde el espacio extracelular hacia el espacio ¡ntracelular de... [Seguir leyendo]

1. Uso de una molécula modular de transporte de antígenos (molécula MAT) - formada por al menos un módulo de translocación que promueve el transporte de la molécula MAT desde el espacio extracelular hacia el interior de la célula, al menos un módulo de selección de dianas que promueve el transporte intracelular de la molécula MAT a los orgánulos involucrados en el procesamiento de antígenos o en la carga de moléculas MHC II con antígenos y al menos un módulo de antígeno que como mínimo es una unidad de la molécula que consta de un antígeno y que determina la especificidad de una respuesta inmunitaria en un sujeto modulada por la molécula MAT - para elaborar un medicamento destinado a la profilaxis o al tratamiento de una enfermedad infecciosa, de una enfermedad autoinmune, de una alergia, de una enfermedad reumática, de una reacción de rechazo a un órgano trasplantado y/ de una enfermedad maligna.

2. Uso según la reivindicación 1, en que el módulo de translocación es una secuencia de aminoácidos, el módulo de selección de dianas es una secuencia de aminoácidos y el módulo de antígeno es una proteína o un péptido.

3. Uso según una de las reivindicaciones 1 o 2, en que los módulos individuales están acoplados entre sí por enlaces covalentes.

4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3, en que la molécula MAT presenta una estructura lineal.

5. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, en que la molécula MAT contiene hasta dos módulos de antígeno, hasta dos módulos de selección de dianas y hasta dos módulos de translocación.

6. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 5, en que al menos un módulo de translocación contiene como mínimo una de las siguientes secuencias o al menos una parte funcional de las mismas para el transporte de la molécula MAT desde el espacio extracelular hacia el interior de la célula: VIH-Tat, Antennapedia, VP22, secuencias de poliarginina o polilisina de 4 hasta 20 aminoácidos de longitud o secuencias invertidas de las antes citadas.

7. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6, en que al menos un módulo de selección de dianas contiene una de las siguientes secuencias o estructuras una parte funcional de estas secuencias: cadena invariante de MHC (IÍP33, IÍP4I, IÍP35, IÍP43), cadena beta de MHC II, receptor de manosa-6-fosfato, inmunoglobulina unida a membrana (mlg), cadena beta de HLA-DM, LAMP-1, LAMP-2, LAMP-3, Limp 1, CD63, CA82, CD1b o secuencias invertidas de las antes citadas.

8. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 7, en que al menos un módulo de antígeno es una proteína, un ácido nucleico, una estructura sacárida o un lípido.

9. Uso según la reivindicación 8, en que el antígeno se puede preparar por métodos combinatorios.

10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9, en que además hay al menos un módulo de etiqueta.

11. Uso según la reivindicación 10, en que al menos un módulo de etiqueta se elige del grupo formado por His-

Tag con 4 hasta 6 restos consecutivos de histidina, Myc-Tag. FLAG-Tag, HA-Tag, Strep-Tag, Xpress-Tag, S-Tag, CBD-Tag, GST-Tag, HSV-Tag, T7-Tag, proteína A-Tag, V5-Tag, etiqueta fijadora de quitina, etiqueta fijadora de maltosa, etiqueta fijadora de calmodulina o un grupo de biotina.

12. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 11, en que los módulos están unidos entre sí mediante módulos espaciadores.

13. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 12 para la profilaxis o terapia de alergias.

14. Uso según la reivindicación 13, en que el módulo de antígeno es como mínimo un alérgeno elegido del grupo

formado por Feld 1, Bet v 1, Bet v 2, Der p 1, PLA 2.

15. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, en que el medicamento contiene además, como mínimo, uno de los siguientes ingredientes y/u otras sustancias auxiliares y aditivos farmacéuticamente aceptables:

a) una solución fisiológica de cloruro sódico

b) un adyuvante farmacéuticamente aceptable

c) una sustancia tampón farmacéuticamente aceptable

d) una proteína soporte farmacéuticamente aceptable

e) un conservante farmacéuticamente aceptable

f) un colorante farmacéuticamente aceptable

16. Uso de (i) una secuencia de ácidos nucleicos codificadora de la molécula MAT según la reivindicación 1, ¡i) un vector que contiene al menos una secuencia de ácidos nucleicos codificadora de una molécula MAT según una de

las reivindicaciones anteriores, iii) una célula o línea celular primaria que contiene al menos un vector y/o una secuencia de ácidos nucleicos según i) o i¡), o iv) exosomas, dexosomas o liposomas que contienen al menos una molécula MAT según una de las reivindicaciones 1 hasta 14, un ácido nucleico codificador de la misma o un vector que contiene este ácido nucleico, para elaborar un medicamento destinado a la profilaxis o al tratamiento de una 5 enfermedad infecciosa, de una enfermedad autoinmune, de una alergia, de una enfermedad reumática, de una reacción de rechazo a un órgano trasplantado y/ de una enfermedad maligna.

17. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, en que el medicamento es una vacuna.

10 18. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el preparado inyectable está

diseñado para inyectarlo en un nodo linfático o aplicarlo a través de las mucosas.