Moléculas de ácido nucleico de nicotiana y usos de las mismas.

Una planta de tabaco que tiene una mutación en un gen endógeno para nicotina desmetilasa que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:

4, en donde la mutación se selecciona del grupo que consiste en una mutación puntual, una supresión, una inserción, una duplicación y una inversión, y en donde dicha planta de tabaco exhibe expresión reducida del gen mutado para nicotina desmetilasa o el producto génico en relación con una planta de control no mutada, o la nicotina desmetilasa codificada por el gen mutado exhibe actividad enzimática reducida con relación a una nicotina desmetilasa no mutada.

Moléculas de ácido nucleico de nicotiana y usos de las mismas

La presente invención se refiere a enzimas citocromo p450 (en lo sucesivo, p450 y enzimas p450), en plantas de Nicotiana, en particular con plantas de tabaco que tienen una mutación en un gen endógeno para nicotina desmetilasa, con tabaco curado elaborado a partir de dichas plantas, y un método para reducir la expresión de nicotina desmetilasa en una planta de tabaco, como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes

Durante la maduración o curado del tabaco se altera la expresión de diversos genes. Tales genes pueden afectar las rutas metabólicas implicadas en la formación de numerosos metabolitos secundarios, incluyendo terpenoides, polifenoles, y alcaloides que afectan a rasgos de calidad del producto final. Por ejemplo, la bioconversión de la nicotina para formar nornicotina durante la senescencia de la planta y en la fase de curado de la hoja o poscosecha, se produce en muchas especies de Nicotiana. La nicotina es la principal fuente de nornicotina. El alcaloide nornicotina, es un sustrato para la nitrosación mediada por microbios para formar la nitrosamina específica del tabaco (TSNA) N'-nitrosonornicotina (NNN) durante el curado de la hoja o el almacenamiento y procesamiento posterior de la hoja.

Los genes expresados durante la maduración o el curado del tabaco pueden ser genes constitutivamente expresados, inducidos por etileno o relacionados con la senescencia, por ejemplo, los genes que codifican un citocromo p450. Los citocromos p450, por ejemplo, catalizan reacciones enzimáticas para una amplia gama de sustratos químicamente diferentes que incluyen al metabolismo oxidativo, peroxidativo, y reductivo de sustratos endógenos y xenobióticos. En las plantas, los p450 participan en las rutas bioquímicas que incluyen la síntesis de productos vegetales tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glicósidos cianogénicos, y glucosinolatos estudiados (Chappell, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 521 - 547, 1995). Los citocromos p450, también conocidos como proteínas hemo-tiolato p450, por lo general actúan como oxidasas terminales en las cadenas de transferencia de electrones de múltiples componentes, llamados sistemas monooxigenasa que contienen p450. Las reacciones específicas catalizadas por estos sistemas enzimáticos incluyen desmetilación, hidroxilación, epoxidación, N-oxidación, sulfooxidación, N, S, y O-desalquilaciones, desulfatación, desanimación y reducción de grupos azo, nitro, y N-óxido.

Los diversos papeles de las enzimas p450 de la planta de Nicotiana han sido implicados en la realización de una variedad de metabolitos vegetales tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glicósidos cianogénicos, glucosinolatos, y una serie de otras entidades químicas. Algunas enzimas p450 pueden afectar la composición de metabolitos de las plantas. Por ejemplo, se ha deseado durante mucho tiempo mejorar el sabor y el aroma de ciertas plantas alterando un perfil de la planta de ácidos grasos seleccionados a través de fitomejoramiento; sin embargo, muy poco se sabe acerca de los mecanismos que intervienen en el control de los niveles de estos constituyentes de la hoja. La subregulación o sobrerregulación de las enzimas p450 asociadas con la modificación de los ácidos grasos puede facilitar la acumulación de ácidos grasos deseados que proporcionan cualidades fenotípicas más preferidas de la hoja.

La función de las enzimas p450 y su gran cantidad de funciones en componentes de las plantas aún están por descubrirse. Por ejemplo, se encontró que una clase especial de enzimas p450 cataliza la descomposición de ácidos grasos en aldehidos y (3-alcoholes volátiles C6 y C9 que son los principales contribuyentes del olor "verde fresco" de frutas y verduras. El nivel de otras p450 novedosas específicas puede ser alterado para mejorar las cualidades de los constituyentes de la hoja mediante la modificación de la composición de lípidos y metabolitos de degradación relacionados en la hoja de Nicotiana. Varios de estos constituyentes en la hoja se ven afectados por la senescencia que estimula la maduración de las propiedades de calidad de la hoja. Sin embargo, otros informes han demostrado que las enzimas p450 juegan un papel funcional en la alteración de los ácidos grasos que están involucrados en las interacciones planta-patógeno y de resistencia a las enfermedades.

La gran multiplicidad de formas de la enzima p450, sus diferentes estructuras y funciones han hecho muy difícil su investigación sobre enzimas p450 de Nicotiana antes de la presente invención. Además, la clonación de enzimas p450 se ha visto obstaculizada por lo menos en parte debido a que estas proteínas localizadas en la membrana están típicamente presentes en baja cantidad y, a menudo son inestables durante la purificación. Por lo tanto, existe la necesidad para la identificación de enzimas p450 en plantas y las secuencias de ácido nucleico asociadas con esas enzimas p450. En particular, sólo se han reportado unas pocas proteínas citocromo p450 en Nicotiana. La invención descrita en la presente invención implica el descubrimiento de las citocromo p450 y fragmentos de citocromo p450 que corresponden a varios grupos de especies de p450 con base en su identidad de secuencia.

Además de las secuencias de p450, la presente invención abarca el descubrimiento de otras secuencias constitutivas y de etileno o inducidas por senescencia que abordan la necesidad de la regulación de las rutas

metabólicas implicadas en la formación de metabolltos secundarios que afectan la calidad de un producto de tabaco. Estas secuencias también son útiles en el desarrollo de germoplasmas de plantas que tienen características deseables para uso en programas de fitomejoramiento para desarrollar germoplasmas más deseables, y especialmente de germoplasmas que no son del tipo OGM (organismo genéticamente modificado).

Resumen de la invención

Los presentes Inventores han identificado y caracterizado secuencias constitutivas, y de etlleno e inducidas por senescencia, incluyendo un clon genómlco de nicotina desmetilasa, del tabaco. También se describe aquí el uso de estas secuencias en los métodos de fitomejoramiento y en los métodos para crear una planta (por ejemplo, una planta transgénica) que tiene características deseables, tales como niveles alterados de nornicotina o N'- nltrosonornicotina ("NNN") o ambos en relación con una planta de control.

En aspectos relacionados la invención presenta una planta de tabaco como se define en las reivindicaciones. En aún un aspecto relacionado adicional, la descripción presenta un cultivo de tejido de células de tabaco que pueden ser regeneradas obtenidas a partir de cualquiera de las plantas engendradas o producidas de acurdo con los métodos descritos aquí. Tales cultivos de tejidos regeneran plantas de tabaco capaces de expresar todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de tabaco que tiene una variante de la expresión del gen para nicotina desmetilasa o un atributo modificado. Ejemplos de células que pueden ser regeneradas son embriones, células meristemáticas, semillas, polen, hojas, raíces, puntas de las raíces o flores o son protoplastos o callos derivados de los mismos.

En aspectos aún relacionados, la descripción presenta un método para la producción de un producto de tabaco que implica: (a) proporcionar una planta de tabaco producida de acuerdo con cualquiera de los métodos de fitomejoramiento antes mencionados; y (b) la preparación de un producto de tabaco a partir de la planta de tabaco. Los ejemplos de productos de tabaco incluyen hojas o tallos o ambos; un producto de tabaco sin humo; un tabaco húmedo o seco; tabacos para mascar; cigarrillos; cigarros; cigarritos; tabacos de pipa; o bidis.

Un aspecto adicional presenta un método para reducir la expresión o la actividad enzimática de un polipéptido del tabaco constitutivo, o Inducido por etileno o inducido por senescencia en una célula vegetal. Este método implica reducir el nivel o la actividad enzimática de un polipéptido endógeno del tabaco constitutivo, o inducido por etileno o por senescencia en la célula vegetal. En una realización deseable, el polipéptido del tabaco es un p450. En otras realizaciones deseables, la célula vegetal es de una especie de Nicotiana.

Un aspecto adicional presenta una molécula aislada de ácido nucleico, por ejemplo, una secuencia de ADN, que contiene una secuencia de nucleótldos que codifica una nicotina desmetilasa. En realizaciones deseables, la secuencia de nucleótidos del primer aspecto es sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica una nicotina desmetilasa... [Seguir leyendo]

1. Una planta de tabaco que tiene una mutación en un gen endógeno para nicotina desmetilasa que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, en donde la mutación se selecciona del grupo que consiste en una mutación puntual, una supresión, una inserción, una duplicación y una inversión, y en donde dicha planta de tabaco exhibe expresión reducida del gen mutado para nicotina desmetilasa o el producto génico en relación con una planta de control no mutada, o la nicotina desmetilasa codificada por el gen mutado exhibe actividad enzimática reducida con relación a una nicotina desmetilasa no mutada.

2. La planta de la reivindicación 1, en donde la expresión de la SEQ ID NO: 4 es silenciada.

3. La planta de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha mutación es una mutación puntual o una supresión.

4. La planta de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la planta de tabaco es un tabaco negro, tabaco Burley, tabaco curado al humo, tabaco Virginia, curado al aire, o tabaco oriental.

5. Tabaco curado elaborado a partir de la planta de tabaco de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

6. Un método para reducir la expresión de la nicotina desmetilasa en una planta de tabaco, dicho método comprendiendo expresar un transgén que codifica una molécula de ARN bicatenario que inhibe la expresión de una nicotina desmetilasa codificada por la SEQ ID NO: 4 en dicha planta, dicha molécula de ARN bicatenario comprendiendo al menos 25 nucleótidos consecutivos que tienen 91% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4, en donde la expresión de dicha nicotina desmetilasa es inhibida en dicha planta en relación con una planta de tabaco que carece de dicho transgén.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha planta de tabaco es de una especie seleccionada del grupo que consiste de Nicotiana tabacum, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tomentosiformis y Nicotiana glauca.

8. El método de la reivindicación 6, en donde dicha planta de tabaco es Nicotiana tabacum.

9. El método de la reivindicación 6, 7, u 8, en donde dicho transgén comprende un promotor constitutivo.

10. El método de la reivindicación 6, 7, u 8, en donde dicho transgén comprende un promotor inducible.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde dicha molécula de ARN bicatenario comprende al menos 100 nucleótidos que tienen 91% o más de identidad de secuencia con un intrón o un exón de la SEQ ID NO: 4.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde dicha molécula de ARN bicatenario comprende al menos 100 nucleótidos que tienen 100% de identidad de secuencia con un intrón o un exón de la SEQ ID NO: 4.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde dicha molécula de ARN bicatenario comprende al menos 250 nucleótidos que tienen 91% o más de identidad de secuencia con un intrón o un exón de la SEQ ID NO: 4.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde dicha molécula de ARN bicatenario comprende al menos 250 nucleótidos que tienen 100% de identidad de secuencia con un intrón o un exón de la SEQ ID NO: 4.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en donde dicha molécula de ARN bicatenario comprende al menos 500 nucleótidos que tienen 91% o más de identidad de secuencia con un intrón o un exón de la SEQ ID NO: 4.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 12-15, en donde dicha molécula de ARN bicatenario comprende al menos 100 nucleótidos que tienen 100% de identidad de secuencia con los nucleótidos 2010 a 2949 o 3947 a 4562 de la SEQ ID NO: 4.