Microscopio, método y programa de ordenador para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, y kit para adaptar un microscopio óptico.

Microscopio, método y programa de ordenador para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital,

y kit para adaptar un microscopio óptico.

El microscopio comprende:

- una fuente de luz coherente (1) y un divisor de haz (3) para generar un haz objeto (Lo), para iluminar una muestra, y un haz de referencia (Lr);

- un sistema óptico con un camino óptico principal que constituye un sistema afocal y telecéntrico, y un camino óptico de referencia; y

- unos medios de registro (12) que registran un holograma de dicha muestra en el plano imagen del sistema óptico.

El método comprende registrar un holograma en el plano imagen de un sistema óptico afocal y telecéntrico.

El programa de ordenador está adaptado para implementar parte de las etapas del método.

El kit comprende unos medios para variar el ángulo de inclinación de un haz de referencia.

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Microscopio, método y programa de ordenador para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, y kit para adaptar 5 un microscopio óptico Sector de la técnica La presente invención concierne en general, en un primer aspecto, a un microscopio para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, que incluye un sistema óptico afocal y telecéntrico, y más particularmente a un microscopio con unos medios de registro que registran un holograma en el plano imagen del sistema óptico.

Un segundo aspecto de la invención concierne a un método para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, que comprende registrar un holograma en el plano imagen de un sistema óptico afocal y telecéntrico.

Un tercer aspecto de la invención concierne a un programa de ordenador adaptado para 20 implementar parte de las etapas del método del segundo aspecto.

Un cuarto aspecto de la invención concierne a un kit para adaptar un microscopio óptico para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, que comprende, entre otros elementos, unos medios para controlar y variar el ángulo de inclinación de un haz de referencia.

Estado de la técnica anterior La característica que hace única la MHD (Microscopía Holográfica Digital) es su capacidad de obtener imágenes cuantitativas de fase [3, 4, 6] de muestras transparentes con dimensiones microscópicas sin la necesidad de marcarlas o tintarlas. Si bien existen otros métodos de microscopia que permiten analizar objetos de fase, éstos sólo proporcionan información cualitativa de la fase del espécimen [16]; métodos como los del Zernike y Nomarsky pueden ser nombrados en esta categoría. La MHD permite la recuperación de la amplitud compleja difractada por un objeto por medio del uso de los principios de la P201331584

holografía digital [17]. A partir del conocimiento de la amplitud compleja difractada por el objeto, es posible calcular imágenes de amplitud o fase.

Los métodos convencionales de MHD [1-4, 6, 7, 9, 10, 18, 19] hacen uso de registro fuera de plano imagen y/o no utilizan sistemas afocales-telécentricos para el registro de los hologramas. El registro fuera de plano imagen es una característica heredada desde el inicio del desarrollo moderno y más extendido de la MHD [4] y que se ha conservado hasta nuestros días [5, 20]. Dicha condición introduce en la MHD varias características indeseadas:

â?¢ No es posible obtener información del espécimen en tiempo real. Se requiere la aplicación de algoritmos de propagación numérica para recuperar la información del experimento, el usuario del MHD observa en la pantalla del microscopio un holograma en lugar de la imagen del espécimen.

â?¢ No se aprovecha el diseño optimizado de los objetivos de microscopio para operar en sus planos objeto-imagen conjugados, introduciendo aberraciones ópticas en los hologramas registrados.

â?¢ Las dos características anteriores sumadas hace que los sistemas de MHD disponibles en la actualidad no puedan proporcionar imágenes cuya resolución está limitada sólo por la difracción (como sucede con las imágenes proporcionadas por un microscopio óptico convencional) sino que proporciona imágenes cuya resolución es sensiblemente peor.

Al igual que el registro fuera de plano imagen, el uso de esquemas no afocales-telécentricos para el registro de los hologramas en los sistemas de MHD, fue propuesto desde su inicio [3, 4] y se mantiene hasta nuestros días [5, 21]. En la literatura se han propuesto algunas alternativas para realizar el registro de los hologramas de MHD [7, 8, 22]. La arquitectura no afocal-telecéntrica que se emplea comúnmente en MHD hace que el sistema presente las siguientes dificultades:

â?¢ Las imágenes reconstruidas de fase de MHD presentan aberración de curvatura de fase [3], lo que impone el empleo de complejos métodos numéricos para su 35 eliminación a posteriori [1, 9-11, 18, 21].

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â?¢ Adicionalmente a la complejidad de los métodos numéricos para la compensación de la curvatura de fase, se ha demostrado que dichas aproximaciones numéricas mantienen una curvatura remanente que perturba las medidas cuantitativas de fase [23].

â?¢ Sin importar el espesor de la muestra en estudio, las imágenes de fase sufren envolvimiento de fase heredado de la curvatura del sistema de registro [1, 3-5, 21].

â?¢ Los órdenes difractados que portan la información de la muestra en estudio se

esparcen en el dominio espectral lo que dificulta el correcto filtrado de imágenes gemelas y orden cero [18].

â?¢ La compensación automática del haz de referencia en configuraciones fuera de eje se dificulta debido al esparcimiento de los órdenes difractados del holograma. 15

â?¢ El esparcimiento de los órdenes difractados limita el espacio ancho de banda disponible, lo que reduce la resolución espacial límite alcanzable por el MHD, la cual será en cualquiera caso inferior a la alcanzable por el microscopio óptico operando con el mismo sistema de lentes objetivos.

La solución de las características negativas arriba indicadas ha derivado en la propuesta de sistemas de MHD que hacen exclusivamente la tarea de cuantificación de fase a-posteriori a un costo computacional y económico elevado. El alto costo computacional de la metodología limita su aplicación en tareas que demanden información cuantificada de fase en tiempo real y su elevado costo económico ha hecho de la técnica una herramienta exclusiva de muy pocos centros de desarrollo e investigación.

En general, los sistemas previos de cuantificación de fase por medio de MHD se han realizado por medio del desarrollo de microscopios independientes, con registro fuera del 30 plano imagen y, en general, sin el uso de sistemas afocales-telecéntricos. Por esta razón las metodologías previas de cuantificación de fase por MHD requieren i) propagación del campo complejo recuperado a partir del holograma, y ii) compensación numérica de la curvatura de fase introducida por el uso de sistemas de registro no afocales-telecéntricos. Estas condiciones imponen las arriba indicadas características poco atractivas para los actuales sistemas de MHD.

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No obstante, existen artículos en los que se propuso el uso, en MHD, de sistemas afocaltelecéntricos [8] y se estudió el efecto que la curvatura de fase residual de los procesos de compensación numérica tiene en las imágenes cuantitativas de fase [23].

En el MHD con sistema afocal-telecéntrico descrito en [8], como en todos los MHDs conocidos, registran el holograma en un plano más lejano al plano imagen, que es donde recomienda el estado de la técnica, como por ejemplo se hace en [3, 20], donde se establece que el estado de la técnica aconseja registrar el holograma en un plano mucho más lejano al plano imagen o foco del microscopio para holografía off-axis, para evitar problemas tales como: la mala utilización del rango dinámico de las cámaras digitales al registrar detalles brillantes de los objetos o el ensanchamiento de las altas frecuencias espaciales [20].

Todo ello hace que, en los microscopios holográficos conocidos en el estado de la técnica, se obtenga un holograma que no tiene parecido alguno con el espécimen en estudio, por lo que no se puede enfocar la muestra cuando se toma la imagen, es decir no se puede enfocar en tiempo real, no siendo posible obtener información del espécimen en tiempo real, resultando necesario un post-procesado [39] y propagación numérica para recuperar la información del experimento.

En resumen, existen microscopios ópticos convencionales que pueden enfocar la muestra y obtener imágenes 2D y por otro lado los microscopios holográficos que no pueden enfocar la muestra en tiempo real y registran hologramas, a partir de los cuales se puede recuperar la información 3D de la muestra mediante métodos a-posteriori. El usuario de los MHD actuales no tiene la posibilidad de enfocar la muestra en tiempo real, puesto que el usuario observa en la pantalla del microscopio un holograma en lugar de la imagen real del espécimen. El enfoque se realiza de forma digital con el procesado diferido del holograma registrado.

En las referencias [24-28] se describen diferentes propuestas de MHDs convencionales, producidos y comercializados, y en [29-37] se presentan documentos de patente que describen diferentes MHDs del estado de la técnica.

Por otra parte, en [19] y en [38] se describe la implementación de un módulo o kit de MHD a un microscopio...

1. Microscopio para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, que comprende: 5

- una fuente de luz coherente (1) y un divisor de haz de luz coherente (3) dispuesto a la salida de la misma para generar un haz objeto (Lo) , con el que iluminar una muestra, y un haz de referencia (Lr) ;

- unos medios de registro (12) que registran un holograma de dicha muestra a partir de un patrón de interferencia de dicho haz de referencia (Lr) y de un haz generado (Loâ?) en dicha muestra por la transmisión o reflexión de dicho haz objeto (Lo) sobre la misma; y - un sistema óptico que incluye elementos ópticos dispuestos distanciados entre sí 15 formando:

- un camino óptico principal entre un punto de entrada de dicho haz objeto (Lo) y dichos medios de registro (12) , que incluye unos elementos ópticos que constituyen un sistema afocal y telecéntrico; y

- un camino óptico de referencia dispuesto entre un punto de entrada de dicho haz de referencia ydichos medios de registro (12) , y que comparte parte de los elementos ópticos con dicho camino óptico principal;

estando el microscopio caracterizado porque dichos medios de registro (12) registran dicho holograma en el plano imagen de dicho sistema óptico.

2. Microscopio según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho sistema óptico comprende, en dicho camino óptico principal, un objetivo (16) que recoge dicho haz

generado (Loâ?) en dicha muestra y una lente de tubo (18) , formando dicho holograma en el plano focal imagen de dicha lente de tubo.

3. Microscopio según la reivindicación 2, caracterizado porque el sistema óptico comprende, en dicho camino óptico principal, los siguientes elementos ópticos, dispuestos en orden desde dicho punto de entrada del haz objeto (Lo) hasta los medios de registro (12) : un primer divisor de haz (8) que permite el paso del haz objeto a su través, una lente

condensadora (14) , un elemento porta-muestras (15) , dicho objetivo (16) , un espejo (23â?) , dicha lente de tubo (18) , un segundo divisor de haz (8â?) que refleja el haz objeto, una lente (9) , un espejo abatible o lámina separadora (10) y una lente formadora de imagen (11) .

4. Microscopio según la reivindicación 3, caracterizado porque el sistema óptico comprende, en dicho camino óptico de referencia, los siguientes elementos ópticos, dispuestos en orden desde dicho punto de entrada del haz de referencia (Lr) y los medios de registro (12) : una lente colimadora de inclinación variable (7) que permite variar el ángulo que forma el haz de referencia con el eje óptico del microscopio, dicho segundo divisor de haz (8â?) que permite el paso del haz de referencia a su través, dicha lente (9) , dicho espejo abatible o lámina separadora (10) y dicha lente formadora de imagen (11) .

5. Microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende, dispuesto entre una de las salidas del divisor de haz de luz coherente (3) y dicho punto de entrada del haz de referencia un variador de intensidad y camino óptico (5) .

6. Microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque está previsto también para la obtención de imágenes por medio de microscopía óptica, para lo cual comprende:

- una fuente de luz blanca (21) dispuesta para iluminar dicha muestra;

- una disposición de elementos ópticos que incluyen a los elementos ópticos de dicho 25 camino óptico principal de dichosistema óptico dispuestos entre dicha fuente de luz blanca (21) y los medios de registro (12) ; y - dichos medios de registro (12) que registran también una imagen óptica de dicha muestraen el plano imagen del sistema óptico.

3.

7. Microscopio según la reivindicación 6 cuando depende de la 4, caracterizado porque comprende además una lente (22) dispuesta a la salida de dicha fuente de luz blanca (21) , un ocular (13) dispuesto para recibir el haz de luz blanca reflejado por dicho espejo abatible o lámina separadora (10) y permitir la visión directa de la imagen óptica de la muestra y un 35 mecanismo de enfoque (17) .

8. Microscopio según la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque comprende unos medios de selección para seleccionar trabajar de manera alternativa según microscopía holográfica digital o según microscopía óptica.

9. Microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende unos medios de control que controlan la operación de los elementos del microscopio y que incluyen unos medios de procesamiento en conexión con los medios de registro que reciben el holograma registrado, en formato digital, y lo procesan para calcular la fase cuantitativa de la muestra.

1.

10. Método para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, que comprende:

- generar un haz de luz coherente y dividirlo en un haz objeto (Lo) y un haz de 15 referencia (Lr) ;

- emitir dicho haz objeto (Lo) sobre una muestra para generar en la misma un correspondiente haz (Loâ?) por la transmisión o reflexión de dicho haz objeto sobre dicha muestra, pasando dicho haz objeto (Lo) por parte de un camino óptico principal de un sistema óptico y dicho haz generado (Loâ?) por el resto de dicho camino principal, donde dicho camino principal comprende unos elementos ópticos que constituyen un sistema afocal y telecéntrico formado por al menos un objetivo, para recoger dicho haz generado (Loâ?) en dicha muestra, y una lente de tubo; y - registrar un holograma de dicha muestra a partir de un patrón de interferencia de dicho haz de referencia (Lr) y de dicho haz generado (Loâ?) en la muestra; estando el método caracterizado porque comprende registrar dicho holograma en el plano imagen de dicho sistema óptico, al final de dicho camino principal.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho sistema óptico es el sistema óptico de un microscopio óptico, realizándose dicho registro de dicho holograma en unos medios de registro del microscopio óptico.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende ajustar los siguientes parámetros del microscopio óptico para proporcionar un holograma digital cuya

imagen cuantitativa de fase tenga una resolución lateral máxima y perturbación mínima, y hacer un uso optimizado del espacio ancho de banda para obtener imágenes limitadas únicamente por la difracción:

NA: apertura numérica del objetivo del microscopio óptico;

M: aumento lateral de dicho sistema telecéntrico;

ï?p: tamaño de los píxeles de dichos medios de registro; y ï?: ángulo que forma el haz de referencia con el eje óptico del microscopio;

de manera que se cumplan las siguientes relaciones:

NA M ï£ 2 ï? ï?¬ 2 ï?« 3ï?©ï?p y sinï?­1 ï ïï§ 3 8ï?° NA M ï¶ ïï· ï£ ï?

donde λ es la longitud de onda del haz de luz coherente.

13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque comprende capturar y procesar dicho holograma mediante la realización de las siguientes etapas de manera secuencial, en bucle cerrado:

- adquisición del holograma digital;

- cálculo de la transformada de Fourier rápida del holograma digital;

- filtrado en el dominio de Fourier del orden objeto e identificación automática del ángulo formado por el haz de referencia y su correspondiente compensación, si se trabaja fuera de eje, o corrimiento de fase, si se trabaja en eje;

- cálculo de la transformada inversa de Fourier rápida del orden objeto; y

- cálculo de la fase cuantitativa del espécimen o muestra.

14. Programa de ordenador que incluye instrucciones de código que cuando se ejecutan en un ordenador implementan las etapas del método según la reivindicación 13.

15. Kit para adaptar un microscopio óptico para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, del tipo que comprende:

- una fuente de luz coherente (1) y un divisor de haz de luz coherente (3) conectado o a conectar a la salida de la misma para generar, por una primera salida, un haz objeto (Lo) , con el que iluminar una muestra, y, por una segunda salida, un haz de referencia (Lr) ; 5

- unos primeros medios de guiado de luz coherente a conectar entre dicha primera salida de dicho divisor de haz de luz coherente (3) y un punto de entrada de un camino óptico principal del microscopio óptico que incluye unos elementos ópticos que constituyen un sistema afocal y telecéntrico y que discurre entre dicho punto de entrada y unos medios de registro (12) del microscopio óptico;

- unos segundos medios de guiado de luz coherente a conectar entre dicha segunda salida de dicho divisor de haz de luz coherente (3) y un punto de entrada de un camino óptico de referencia que comparte parte de los elementos ópticos con dicho camino óptico principal y que finaliza en dichos medios de registro (12) ;

- un elemento óptico a disponer en dicho camino óptico de referencia para conferirle una inclinación determinada al haz de referencia (Lr) con respecto al eje óptico del microscopio óptico;

estando el kit caracterizado porque comprende además:

- unos medios de soporte para soportar a dicho elemento óptico con una inclinación variable, 25

- unos medios de actuación para variar la inclinación del elemento óptico, actuando sobre el mismo o sobre dichos medios de soporte, - un sistema de control en lazo cerrado para evaluar automáticamente en el espacio de Fourier una serie de parámetros del microscopio óptico que determinan el desempeño del microscopio cuando se utiliza para la obtención de imágenes cuantitativas de fase por medio de microscopía holográfica digital, determinar un valor óptimo de ángulo de inclinación ï?ï? para el haz de referencia (Lr) , a partir del resultado de dicha evaluación, y controlar a dichos medios de actuación para que realicen dicha variación de inclinación de acuerdo con dicho valor óptimo de ángulo de inclinación ï?.

16. Kit según la reivindicación 15, caracterizado porque dichos medios de soporte y dichos medios de actuación comprenden una plataforma de rotación motorizada (PM) configurada para variar la inclinación del elemento óptico por el giro de la misma.

.

17. Kit según la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque:

- dichos primeros medios de guiado de luz coherente comprenden un tramo de fibra óptica (4) con un primer extremo a conectar a dicha primera salida del divisor de haz de luz coherente (3) , y un conector de fibra óptica (6) a conectar a un segundo extremo de dicho tramo de fibra óptica (4) y previsto para acoplarse a una primera abertura de entrada del microscopio óptico definida en dicho punto de entrada del camino óptico principal;

- dichos segundos medios de guiado de luz coherente comprenden un conductor de fibra óptica (4â?) , con un elemento variador de intensidad y camino óptico (5) incorporado, 15 teniendo dicho conductor de fibra óptica (4â?) un primer extremo a conectar a dicha segunda salida del divisor de haz de luz coherente (3) , y un conector de fibra óptica (6â?) a conectar a un segundo extremo de dicho conductor de fibra óptica (4â?) y previsto para acoplarse a una segunda abertura de entrada del microscopio óptico definida en dicho punto de entrada del camino óptico de referencia o a un elemento intermedio acoplado a dicha segunda abertura.

2.

18. Kit según la reivindicación 17 cuando depende de la 16, caracterizado porque dicho elemento intermedio es dicha plataforma de rotación motorizada (PM) .

19. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque 25 comprende además:

- un primer divisor de haz (8) a disponer en el microscopio óptico, reemplazando un primer espejo (23) del mismo dispuesto entre una fuente de luz blanca (21) y una lente condensadora (14) del microscopio óptico, de manera que dicho primer divisor de haz (8)

permita el paso del haz objeto (Lo) a su través y refleje el haz de luz blanca (L1) generado por dicha fuente de luz blanca (21) , o viceversa, para dirigir a ambos hacia la lente condensadora (14) ; y - un segundo divisor de haz (8â?) a disponer en el microscopio óptico, reemplazando un segundo espejo (23â?â?) del mismo dispuesto entre una lente de tubo (18) y una lente (9) del microscopio óptico, de manera que dicho segundo divisor de haz (8) permita el paso del

haz de referencia (Lr) a su través y refleje el haz proveniente de la lente de tubo (18) , o viceversa, para dirigir a ambos hacia dichos medios de registro (12) del microscopio óptico.

20. Kit según la reivindicación 19, caracterizado porque dicho elemento óptico de 5 inclinación variable es una lente colimadora de inclinación variable (7) a disponer entre el punto de entrada del haz de referencia y dicho segundo divisor de haz (8â?) .

21. Kit según la reivindicación 15, caracterizado porque dicho sistema de control en lazo cerrado incluye un algoritmo encargado de realizar dicha determinación del valor óptimo de 10 ángulo de inclinación ï?ï? de manera que se cumpla la relación del método según la reivindicación 12:

ï 3 NAï¶

sinï?­1 ï§

ï·ï£ï?

ï

** (Ver fórmula) **

siendo dichos parámetros del microscopio óptico a evaluar en el espacio de Fourier: NA, M y ï?p.