Métodos y composiciones para expresar ARN viral de sentido negativo en células de canino.

Un ácido nucleico aislado que comprende un promotor de ARN polimerasa I canina,

en el que el ácido nucleico comprende

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 26,

(b) un fragmento funcionalmente activo del polinucleótido definido en (a) que comprende al menos 250, o al menos 350, o al menos 450 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 26, o

(c) un polinucleótido que tiene al menos un 99 % de identidad con el polinucleótido definido en (a).

Métodos y composiciones para expresar ARN viral de sentido negativo en células de canino

1. Campo de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un promotor de ARN polimerasa I canina, tal como se define en las reivindicaciones. En otros aspectos, la invención proporciona vectores de expresión y células que comprenden dichos ácidos nucleicos, así como métodos para usar dichos ácidos nucleicos para producir virus de la gripe, incluyendo virus de la gripe infecciosos.

2. Antecedentes

Las pandemias de la gripe se definen por un aumento global dramático en la morbilidad y mortalidad debido a la enfermedad de la gripe. Varios factores se combinan para modular la gravedad y el alcance de la pandemia, incluyendo el bajo grado de inmunidad en la población y la eficacia con la que el virus puede transmitirse entre seres humanos. Esto último está influenciado generalmente no solo por el virus en sí, sino por la densidad de población y la facilidad para viajar dentro y fuera de una región. El virus responsable de la pandemia es generalmente una variante antigénica de reciente aparición con la que la mayoría de la población no ha tenido experiencia previa y para la que, por lo tanto, tienen poca o ninguna inmunidad. Además, la transmisión eficaz de humano a humano es un requisito previo para su rápida difusión y, en el caso de la introducción zoonótica de virus de animales en poblaciones humanas, el virus tiene que adaptarse a la replicación en seres humanos y ser capaz de una transmisión eficiente.

Las pandemias de gripe se extienden muy rápidamente y pueden tener un impacto devastador. La pandemia más grave del siglo XX, la pandemia de 1918, mató más de 5. de ciudadanos de los Estados Unidos y de 2 a 4 millones de personas en todo el mundo. La pandemia puede producir oleadas de la enfermedad, con picos de incidencia separados por varias semanas hasta meses. La aparición y dispersión relativamente rápida de la gripe pandémica presenta varios problemas para responder a un ataque global de esta magnitud, e impone cargas abrumadoras en los servicios de emergencia y en los trabajadores de la salud. La identificación y respuesta rápida a la pandemia emergente es claramente un elemento necesario de la solución; actualmente hay varios programas funcionando en todo el mundo para controlar la aparición de los virus de la gripe, incluyendo los virus de la gripe aviar que de manera infrecuente causan enfermedad en los seres humanos. Estos datos de vigilancia se usan de manera conjunta con los niveles de alerta de pandemia predefinidos para identificar la probabilidad de la amenaza y para proporcionar orientación para una respuesta eficaz.

La vacunación es la medida de salud pública más importante para prevenir la enfermedad causada por las epidemias anuales de gripe. El corto intervalo entre la identificación de una potencial pandemia y la aparición de niveles de enfermedad aumentados de manera significativa presenta desafíos significativos para producir vacunas suficientes como para proteger a un gran segmento de la población. Tener la tecnología de vacunas y la infraestructura de fabricación disponible antes de la aparición de la siguiente pandemia será crítico para mejorar una cantidad significativa de enfermedad y muertes. Los cortos tiempos de respuesta necesarios para producir una "vacuna pandémica" no permitirán que se lleve a cabo una investigación o desarrollo de procesos para proporcionar una respuesta eficaz.

Hasta la fecha, todas las vacunas comerciales para la gripe para cepas no pandémicas en los Estados Unidos se han propagado en huevos de gallina embrionados. Aunque el virus de la gripe crece bien en los huevos de gallina, la producción de vacuna depende la disponibilidad de huevos. Deben organizarse los suministros de huevos, y seleccionarse las cepas para vacunación meses antes de la siguiente temporada de gripe, limitando la flexibilidad de esta estrategia, y dando a menudo como resultado retrasos y escasez en la producción y distribución. Desafortunadamente, algunas cepas de vacuna de gripe, tales como el prototipo de cepa A/Fujian/411/2 que circuló durante la temporada 23-4, no se replica bien en huevos de gallina embrionados, y tiene que aislarse mediante cultivo celular en un procedimiento costoso y laborioso.

Los sistemas para producir virus de la gripe en cultivo celular también se han desarrollado en los últimos años (véase, por ejemplo, Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza págs. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohén & Shafferman (eds) Novel Strateaies in Pesian and Production of Vaccines págs. 141-151). Típicamente, estos métodos implican la infección de células hospedadoras inmortalizadas adecuadas con una cepa seleccionada del virus. Aunque se eliminan muchas de las dificultades relacionadas con la producción de vacunas en huevos de gallina, no todas las cepas patogénicas de gripe crecen bien y pueden producirse de acuerdo con los métodos de cultivo tisular establecidos. Además, muchas cepas con características deseables, por ejemplo, atenuación, sensibilidad a la temperatura y adaptación fría, adecuadas para la producción de vacunas atenuadas vivas, no han crecido satisfactoriamente en cultivo tisular usando métodos establecidos.

Además de los métodos basados en cultivo celular que se basan en Infectar el cultivo celular con virus vivo, se han producido virus de la gripe completamente infecciosos en cultivo celular usando tecnología de ADN recomblnante. La producción de virus de la gripe a partir de ADN recombinante aumenta significativamente la flexibilidad y utilidad de los métodos de cultivo tisular para la producción de vacunas de la gripe. Recientemente, se han comunicado sistemas para producir virus de la gripe A y B a partir de plásmldos recombinantes que incorporan ADNc que codifican el genoma viral. Véase, por ejemplo, Neumann et al. (1999) Generation of influenza A virus entlrely from cloned cDNAs. Proc Nati Acad Sci USA 96:9345-935; Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73:9679-9682; Hoffmann et al. (2) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Nati Acad Sci USA 97:618-6113; documento WO 1/83794; Hoffmann y Webster (2), Unidirectional RNA polymerase l-polymerase II transcrlptlon system for the generation of Influenza A virus from eight plasmids, 81:2843-2847; Hoffmann et al. (22), Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids, 99(17): 11411-11416; Patentes de los Estados Unidos N° 6.649.372 y 6.951.754; Publicaciones de los Estados Unidos N° 253349 y 2537487. Estos sistemas, a menudo citados como "rescate de plásmido", ofrecen el potencial para producir virus recombinantes que expresan las proteínas HA y NA inmunógenas de cualquier cepa seleccionada.

Sin embargo, estos métodos recombinantes se basan en el uso de vectores que comprenden elementos reguladores de ARN polimerasa I (ARN pol I) para dirigir la transcripción del ARNr genómlco viral. Dichos elementos reguladores son necesarios para producir los extremos 5' y 3' definidos del ARN genómlco de la gripe de tal forma que pueda producirse un virus de la gripe plenamente infeccioso. Los sistemas recombinantes actuales, tales como los descritos anteriormente, usan el sistema regulador de la ARN pol I humana para expresar el ARN viral. Debido a la especificidad de especie del promotor de la ARN pol I, estos elementos reguladores solo están activos en células de ser humano o de primate. Por lo tanto, el rescate de plásmidos de virus de la gripe solo ha sido posible hasta la fecha transfectando plásmidos adecuados en células de ser humano o de primate.

Además, dichas células de ser humano o de primate no producen frecuentemente el título suficiente del virus necesario para producir vacunas. Sin embargo, las células de riñón canino Madln-Darby (células MDCK) pueden usarse para replicar cepas de vacunación a un título suficiente como para fabricar vacunas comerciales. Por lo tanto, la producción de una vacuna de la gripe que use rescate de plásmido requiere actualmente el uso de al menos dos cultivos celulares diferentes. La identificación y clonación de las secuencias reguladoras de la ARN pol I canina podría permitir el que el rescate de plásmidos se llevase a cabo en el mismo cultivo celular que la repllcaclón viral, eliminando la necesidad de un cultivo de rescate separado. Como tal, sigue habiendo una necesidad para la identificación y clonación de elementos reguladores de la ARN pol I canina que puedan utilizarse para construir vectores adecuados para el rescate de plásmido en células... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que comprende un promotor de ARN polimerasa I canina, en el que el ácido nucleico comprende

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID N°: 26,

(b) un fragmento funcionalmente activo del polinucleótido definido en (a) que comprende al menos 25, o al menos 35, o al menos 45 nucleótidos contiguos de la secuencia expuesta en SEC ID N°: 26, o

(c) un polinucleótido que tiene al menos un 99 % de identidad con el polinucleótido definido en (a).

2. Una secuencia de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 unida operativamente a ADNc que codifica un ARN genómico viral de cadena negativa o el ARNc correspondiente.

3. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el ARN genómico viral de hebra negativa es un ARN genómico de la gripe.

4. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el ácido nucleico comprende además una secuencia de terminación de la transcripción.

5. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 2, 3, o 4, en el que el ADNc es un ADNc del virus de la gripe seleccionado del grupo que consiste en: ADNc de proteína básica de polimerasa 2 (PB2), ADNc de proteína básica de polimerasa 1 (PB1), ADNc de proteína ácida de polimerasa (PA), ADNc de hemaglutinina (HA), ADNc de nucleoproteína (NP), ADNc de neuramlnldasa (NA), ADNc de proteína de matriz 1 (M1), ADNc de proteína de matriz 2 (M2), ADNc de proteína no estructural 1 (NS1) y de proteína no estructural 2 (NS2).

6. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un método para producir un virus de la gripe recombinante, que comprende cultivar una célula canina que comprende un vector de expresión de la reivindicación 6 y uno o más vectores de expresión que expresan un ARNm que codifica uno o más pollpéptldos de la gripe seleccionados del grupo que consisten en proteína básica de polimerasa 2 (PB2), proteína básica de polimerasa 1 (PB1), proteína ácida de polimerasa (PA), hemaglutinina (HA), nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA), proteína de matriz 1 (M1), proteína de matriz 2 (M2), proteína no estructural 1 (NS1), y proteína no estructural 2 (NS2), en el que al menos ocho vectores de expresión, incorporando cada uno un segmento diferente del genoma de la gripe, se usan para introducir un genoma de la gripe completo en la célula canina; y aislar el virus de la gripe recombinante.

8. Una célula que comprende un vector de expresión de la realización 6.

9. Un método para producir un ARN genómico de la gripe, que comprende introducir el vector de expresión de la realización 6 en células caninas, produciendo de este modo un ARN genómico de la gripe.

1. Un método para producir un virus de la gripe recombinante, que comprende

i) introducir en una población de células caninas vectores de expresión

a) expresar en dichas células segmentos de ARNv genómico para proporcionar los segmentos completos de ARNv de dicho virus, en el que uno o más de dichos vectores de expresión comprenden un ácido nucleico promotor de la ARN polimerasa I canina de acuerdo con la reivindicación 1, y

b) también en dichas células ARNm que codifica uno o más polipéptidos de la gripe seleccionados del grupo que consiste en: proteína básica de polimerasa 2 (PB2), proteína básica de polimerasa 1 (PB1), proteína ácida de polimerasa (PA), hemaglutinina (HA), nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA), proteína de matriz 1 (M1), proteína de matriz 2 (M2), proteína no estructural 1 (NS1), y proteína no estructural 2 (NS2); y

ii) cultivar dichas células produciéndose de este modo partículas virales de la gripe.

11. Un método de la reivindicación 9 o 1, en el que las células caninas son células de riñón.

12. Un método de la reivindicación 1 u 11, en el que el virus de la gripe recombinante es un virus reorganizado.

13. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las partículas de la gripe producidas son infecciosas.

14. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el ARNm codifica la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) de una cepa de gripe patogénica.

15. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el ARNm codifica la proteína básica de polimerasa 2 (PB2), proteína básica de polimerasa 1 (PB1), proteína ácida de polimerasa (PA), hemaglutinina (RA), nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA), proteína de matriz 1 (M1), proteína de matriz 2 (M2), proteína no estructural 1 (NS1) y proteína no estructural 2 (NS2) de una cepa de gripe atenuada.

16. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el virus recombinante se selecciona del grupo que consiste en: un virus de la gripe adaptado al frío, un virus de la gripe atenuado, un virus de la gripe sensible a la temperatura, y un virus de la gripe atenuado, sensible a la temperatura y adaptado al frío.

17. Un método de la reivindicación 16, en el que la cepa de gripe atenuada se selecciona del grupo que consiste en

A/Ann Arbor/6/6, B/Ann Arbor/1/66, B/Leningrado/14/17/55, B14/5/1, B/USSR/6/69, B/Leningrado/179/86, B/Leningrado/14/55, B/lnglaterra/268/76, y A/Puerto Rico/8/34.

18. El vector de expresión pAD4 expuesto como SEC ID N°: 29.