Métodos para la identificación de un anticuerpo o una diana.

Un método para identificar un anticuerpo, una diana o un agente en una muestra,

que comprende las etapas de:

a) obtener los ADNc a partir de los ARNm que codifican inmunoglobulinas en la muestra, obteniendo de este modo una mezcla de los ADNc;

b) secuenciar sin ninguna etapa de clonación previa al menos 1000 de las cadenas pesadas variables (VH) y cadenas ligeras variables (VL) de las inmunoglobulinas presentes en dicha muestra, obteniendo con ello datos de la secuencia;

c) determinar las cadenas VH y VL más abundantes presentes en la muestra usando un algoritmo implemen10 tado por ordenador;

d) sintetizar polinucleótidos que codifican las cadenas VH y VL más abundantes presentes en la muestra y producir anticuerpos que comprenden dichas cadenas VH y VL usando un vector de expresión; y

e) someter a ensayo los anticuerpos, identificando de este modo el anticuerpo o la diana.

Métodos para la identificación de un anticuerpo o una diana CAMPO

Esta descripción se refiere a métodos para la identificación de un anticuerpo, una molécula diana o un agente mediante el análisis de los datos de la secuencia de inmunoglobulinas en una muestra biológica y mediante la determinación de las cadenas VH y VL más abundantes presentes en dicha muestra biológica. También se proporcionan los materiales utilizados para ello.

ANTECEDENTES

Los métodos actuales para la identificación de un anticuerpo o una molécula diana implican procesos laboriosos de aislamiento de anticuerpos a partir de linfocitos B humanos activados. Por ejemplo, el aislamiento de anticuerpos completamente humanos a partir de linfocitos B de pacientes inmunizados o con cáncer se considera una ruta ventajosa para los anticuerpos completamente humanos. Diversas compañías ofrecen servicios comerciales para el aislamiento de linfocitos B individuales procedentes de seres humanos. Estos linfocitos B se inmortalizan o se recupera la información genética de las inmunoglobulinas de las células individuales. Tales métodos pueden implicar técnicas de alto rendimiento que son laboriosas y costosas, incluyendo técnicas para el aislamiento de información genética célula a célula, inmortalizando miles de células y escrutando su rendimiento respectivo sobre el tejido diana.

Desde hace poco tiempo, diversas compañías ofrecen servicios de secuenciación de todo el genoma, o aparatos que se pueden utilizar para realizar las tareas respectivas. Esto incluye el sistema 454 de Roche, el sistema Solexa de Illumina y el sistema Heliscope de Helicos Biosciences. Helicos, por ejemplo, puede secuenciar 2x109 bases en 24 horas con un solo aparato, manteniendo también una distribución cuantitativa de las secuencias diana.

El documento de Patente de Estados Unidos nº 7.288.249 describe un método para la identificación de un antígeno que se expresa diferencialmente en la superficie de dos o más poblaciones celulares distintas. La inmunización activa los linfocitos B para producir una combinación VH-VL que se une al inmunógeno para proliferar (expansión clonal) y para secretar el anticuerpo correspondiente. Sin embargo, el procedimiento de acuerdo con el documento US 7.288.249 implica la clonación de los genes VH y VL (los genes VH y VL se clonan separadamente mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ) , y los genes VH y VL se recombinan aleatoriamente en genotecas de fagos (es decir, no hay una selección de los genes VH y VL más abundantes) , entre las cuales se busca a continuación los clones que se unen a un antígeno, tal y como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) . El ácido nucleico que codifica segmentos génicos variables de anticuerpo (incluyendo los segmentos VH y VL) se recupera a partir de las células de interés y se amplifica. En el caso de genotecas de VH y VL reordenadas, el ADN deseado se obtiene mediante el aislamiento de ADN genómico o ARNm a partir de linfocitos, seguido por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores que se emparejan con los extremos 5' y 3' de genes de VH y VL reordenados. Para encontrar anticuerpos útiles, la genoteca de fagos con anticuerpos no activados se escruta en busca de células cancerosas vivas.

El documento de Patente de Estados Unidos nº 6.897.028 describe un método para la identificación de dianas moleculares en el que una proteína se une a un ligando, el ligando se escruta frente a una genoteca de péptidos o proteínas en donde los miembros peptídicos o proteínicos de la genoteca se seleccionan entre los productos de expresión de una genoteca de ADNc obtenida a partir de una célula y de fragmentos de esos productos de expresión. El procedimiento también implica la determinación de la secuencia de ácido nucleico que codifica los miembros que se han separado de la genoteca y la traducción de estas secuencias de ácidos nucleicos en secuencias peptídicas y la identificación de la proteína.

El documento de Publicación nº 20060141532 (Solicitud con nº de Serie 11/286917) describe métodos para la identificación y el diseño de péptidos inmunogénicos mediante el uso de un protocolo para determinar la secuencia de aminoácidos de ciertas regiones VH o VL de un anticuerpo anti-idiotípico, tal y como se describe en Iwasaki, et al. Eur. J. Immunol., 24: 2874-2881, 1994. La secuencia de aminoácidos del antígeno se determina por técnicas convencionales de análisis de aminoácidos o mediante secuenciación química; la secuencia de aminoácidos de las regiones VH y/o VL del anticuerpo anti-idiotípico se determina mediante secuenciación del ADN genómico o el ADNc que codifica la región respectiva, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

El documento WO2005/094159 describe el aislamiento de péptidos de unión a partir de linfocitos inmortalizados y el análisis de estos péptidos de unión, por lo general inmunoglobulinas del tipo IgM, para estudiar la unión selectiva a tejido tumoral, pero no a tejido sano. El péptido de unión puede inhibir la proliferación de tumores.

El documento WO03/052416 describe una metodología para el aislamiento y la secuenciación de secuencias candidatas de VH y VL procedentes de linfocitos B. Las inmunoglobulinas codificadas por dichas secuencias candidatas de VH y VL son potencialmente útiles en el tratamiento de infecciones. La metodología descrita en el documento WO03/052416, al igual que todos los demás métodos descritos en la técnica anterior, requiere la manipulación de los ácidos nucleicos antes de la secuenciación. En particular, son necesarias etapas de clonación más largas lo que hace imposible poner en práctica el método a una escala tal y como se describe en la presente invención.

Como en el caso del documento WO03/052416, todos los métodos mencionados anteriormente implican un procedimiento de aislamiento laborioso de los ácidos nucleicos que codifican una diana y/o una secuenciación genómica mediante técnicas de rendimiento muy elevado. Sin embargo, sería ventajoso un método menos laborioso, menos costoso y/o más factible para la identificación de una molécula diana, analizando datos de la secuencia de las cadenas VH y VL y determinando la cadena VH y VL más dominante.

COMPENDIO

Las realizaciones de esta descripción se refieren en general a métodos para la identificación de un anticuerpo, una molécula diana o un agente mediante el análisis de los datos de la secuencia de las cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) de las inmunoglobulinas presentes en una muestra biológica. Algunas de las realizaciones en el presente documento se refieren a la determinación de las cadenas VH y VL más abundantes, presentes en una muestra, utilizando un algoritmo predeterminado implementado por ordenado, sintetizando polinucleótidos de las cadenas VH y VL más abundantes para la expresión en un vector, y sometiendo a ensayo los anticuerpos expresados para identificar la molécula diana. Otras realizaciones se refieren a la determinación de las cadenas VH y VL más abundantes presentes en una muestra, utilizando un algoritmo predeterminado implementado por ordenado, sintetizando polinucleótidos de las cadenas VH y VL más abundantes para la expresión en un vector, y sometiendo a ensayo cuál de los anticuerpos expresados se une a una cierta molécula diana o tejido diana. En ciertas realizaciones, la muestra es una muestra biológica que no está seleccionada o enriquecida previamente.

Una realización proporciona métodos de identificación de un anticuerpo, una diana o un agente en una muestra, que comprenden: a) la obtención de los ADNc de los ARNm que codifican inmunoglobulinas en una muestra, obteniendo de este modo una mezcla de ADNc; b) la secuenciación de cada una de las cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (VL) de las inmunoglobulinas, obteniendo de este modo datos de la secuencia de las cadenas VH y VL de las inmunoglobulinas presentes en la muestra; c) la determinación de las cadenas VH y VL más abundantes presentes en la muestra utilizando un algoritmo predeterminado implementado por ordenado; d) la síntesis de polinucleótidos de las cadenas VH y VL más abundantes y la producción de anticuerpos usando un vector de expresión de mamífero; y e) someter a ensayo los anticuerpos, identificando de este modo un anticuerpo que se une a una determinada molécula o tejido diana o la identificación de una molécula diana que se une a un determinado anticuerpo.

Otra realización proporciona métodos de identificación de un anticuerpo, una diana o un agente que comprenden: a) proporcionar una muestra biológica procedente de un mamífero tal como un ser humano,... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar un anticuerpo, una diana o un agente en una muestra, que comprende las etapas de:

a) obtener los ADNc a partir de los ARNm que codifican inmunoglobulinas en la muestra, obteniendo de este 5 modo una mezcla de los ADNc;

b) secuenciar sin ninguna etapa de clonación previa al menos 1000 de las cadenas pesadas variables (VH) y cadenas ligeras variables (VL) de las inmunoglobulinas presentes en dicha muestra, obteniendo con ello datos de la secuencia;

c) determinar las cadenas VH y VL más abundantes presentes en la muestra usando un algoritmo implemen10 tado por ordenador;

d) sintetizar polinucleótidos que codifican las cadenas VH y VL más abundantes presentes en la muestra y producir anticuerpos que comprenden dichas cadenas VH y VL usando un vector de expresión; y e) someter a ensayo los anticuerpos, identificando de este modo el anticuerpo o la diana.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra biológica.

3. El método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra es una muestra biológica procedente de un mamífero.

4. El método según la reivindicación 3, en el que dicho mamífero es un ser humano, múrido, roedor, ratón, rata, ardilla, ardilla rayada, taltuza, puercoespín, castor, hámster, jerbo, cobaya, conejo, perro, gato, vaca o caballo.

5. El método según la reivindicación 4, en el que dicho ser humano es un paciente con cáncer, dicho ser 20 humano está inmunizado o dicho ser humano está infectado con un agente o una molécula diana.

6. El método según la reivindicación 1, en el que los ARNm que codifican inmunoglobulinas se obtienen mediante la recogida o el aislamiento de linfocitos B de la muestra.

7. El método según la reivindicación 1, en el que las inmunoglobulinas son de la clase IgG.

8. El método según la reivindicación 1, en el que los ADNc de los ARNm que codifican inmunoglobulinas en la 25 etapa (a) se generan mediante transcriptasa inversa-PCR.

9. El método según la reivindicación 8, en el que se utilizan cebadores específicos de IgG.

10. El método según la reivindicación 1, en el que las cadenas VH y VL más abundantes presentes en la muestra se determinan mediante el análisis de datos de las secuencias de las cadenas VH y VL presentes en la muestra.

11. El método según la reivindicación 1, en el que los polinucleótidos de VH y VL sintetizados en la etapa (d) se 30 integran en un vector de expresión.

12. El método según la reivindicación 11, en el que dicho vector de expresión es un vector de expresión útil en la expresión de ácidos nucleicos en células hospedadoras de mamífero.

13. El método según la reivindicación 1, en el que los anticuerpos producidos en la etapa (d) se liberan en el medio de cultivo.

14. El método según la reivindicación 1, en el que el ensayo de los anticuerpos en la etapa (e) se lleva a cabo empleando un inmunoensayo.

15. Un método para identificar un anticuerpo, una diana o un agente que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra biológica procedente de un mamífero que está inmunizado, infectado con un agente o una molécula diana o que padece cáncer;

b) recoger los linfocitos B de la muestra biológica; c) obtener los ARNm a partir de los linfocitos B recogidos; d) generar los ADNc de las inmunoglobulinas codificadas por el ARNm, obteniendo de este modo una mezcla de los ADNc; e) secuenciar sin ninguna etapa previa de clonación al menos 1000 de las cadenas pesadas variables (VH) y 45 ligeras variables (VL) de las inmunoglobulinas presentes en dicha muestra, obteniendo con ello datos de la

secuencia;

f) determinar las cadenas VH y VL más abundantes presentes en la muestra usando un algoritmo implementado por ordenador; g) sintetizar los polinucleótidos que codifican las cadenas VH y VL más abundantes presentes en la muestra;

h) integrar los polinucleótidos de VH y VL sintetizados en un vector de expresión útil en la expresión de áci

dos nucleicos en células hospedadoras de mamífero; i) permitir que los vectores con los polinucleótidos de VH y VL integrados expresen los polinucleótidos de VH y VL, produciendo de este modo anticuerpos; y j) someter a ensayo los anticuerpos mediante el uso de un inmunoensayo, identificando de este modo el anti10 cuerpo, la diana o el agente.