MÉTODO PARA PREDECIR LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON RADIOTERAPIA COMBINADA CON QUIMIOTERAPIA BASADA EN CISPLATINO.

Método para predecir la respuesta al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino.

La invención se refiere a un método para predecir la respuesta al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino en pacientes con cáncer, preferiblemente cáncer de pulmón no microcítico, donde dicho método se basa en la detección de la presencia de metilación del gen IGFBP-3. La presente invención también se refiere a un método in vitro para diseñar un tratamiento personalizado de un individuo con dicha enfermedad. El método de la invención puede ser cuantitativo o semicuantitativo. La presente invención también se refiere a una sonda para la detección cuantitativa de la metilación del gen IGFBP-3, a un kit que la comprende y al uso del kit para predecir la respuesta de un sujeto al tratamiento indicado.

La presente invención se refiere a un método para predecir la respuesta al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino en pacientes con cáncer, preferiblemente cáncer de pulmón no microcítico, donde dicho método se basa en la detección de la presencia de metilación del gen IGFBP-3 El método de la invención puede ser cuantitativo o semicuantitativo. La presente invención también se refiere a una sonda para la detección cuantitativa de la metilación del gen IGFBP-3. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo del tratamiento del cáncer.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La terapia combinada de radioterapia y quimioterapia en un paciente con cáncer permite combinar los beneficios de ambas técnicas y ha conseguido mejorar la supervivencia en diversos tipos de cáncer, por ejemplo, cáncer de pulmón, sin embargo, la toxicidad se ve aumentada con dicho tratamiento (Moreno-Jiménez M et al. Rev Med Univ Navarra 51 (4): 13-33).

En quimioterapia, el cisplatino, también denominado c/'s-diaminodicloroplatino (II) (CDDP), es el tratamiento de elección para diversos tipos de cánceres, entre ellos, el cáncer de pulmón no microcítico. El cisplatino se puede administrar en terapia combinada con radioterapia ya que estudios multicéntricos han demostrado mejor respuesta global (Curran WJ, Jr. et al. 2011 Journal of the National Cáncer Institute 103:1452-60).

Se ha descrito que los agentes quimioterápicos basados en platinos, entre los que se encuentra el cisplatino, metilan de novo el promotor de ciertos genes, alterando así su expresión. Entre dichos genes se encuentra el gen que codifica para la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP-3) (Ibáñez de Cáceres I. et al. 2010 Oncogene 29:1681-90).

La hipermetilación de la región 5' del promotor del gen IGFBP-3, es un proceso epigenético que acontece con elevada frecuencia en el cáncer humano (40%-60%) (Chang YS et al. 2002 Clin Cáncer Res 8:3796-802; Ibáñez de Cáceres I et al. 2010 Oncogene 29:1681-90; Torng PL et al. 2009 Mol Cáncer 8:120). La metilación del gen IGFBP-3 puede detectarse a través del uso de diferentes técnicas, como por ejemplo, secuenciación con bisulfito y el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica para metilación (MSP) (Ibáñez de Cáceres I et al. 2010 Oncogene 29:1681- 90; Tomii K et al. 2007 Int J Cáncer 120:566-73; Ibáñez de Cáceres I et al. 2006 Cáncer Res 66:5021-8).

En la actualidad existe una necesidad clínica de conocer si un paciente va a responder o no a un tratamiento combinado de quimioterapia y radioterapia para poder adaptar el tratamiento a cada caso de manera individual, para evitar así los efectos secundarios asociados a la toxicidad de la terapia combinada y evitar el sobretratamiento en pacientes que no vayan a responder al mismo.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

El problema técnico que resuelve la invención es el de proporcionar un método de predicción de la respuesta de un sujeto al tratamiento con radioterapia combinado con quimioterapia basada en platinos.

En la presente invención se demuestra que la detección y/o cuantificación de la región promotora del gen IGFBP-3, en concreto de la región comprendida entre las posiciones -584 y -492 del promotor (posiciones numeradas desde el ATG iniciador), es útil para la predicción de la respuesta de un sujeto que padece cáncer al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en platino, así como para diseñar un tratamiento individualizado del sujeto.

El método de la invención puede realizarse mediante la utilización de parejas de cebadores que detecten la presencia de metilación y/o parejas de cebadores que detecten la ausencia de metilación, lo que en la presente invención se denomina detección semicuantitativa. Además, también puede realizarse mediante el uso de una sonda, lo que permite una detección cuantitativa. Los estudios que demuestran

la invención se llevaron a cabo tanto en líneas celulares como en muestras quirúrgicas de pacientes

Además, los inventores han demostrado que el uso de una sonda que detecta las posiciones -532 y -526 del promotor del gen IGFBP-3, permite la cuantificación del grado de metilación de dicho gen. El uso de la sonda descrita en la invención permite predecir si un sujeto que padecer cáncer va a responder a un tratamiento combinado de quimioterapia basada en platinos y de radioterapia con mayor sensibilidad y eficacia.

Por lo aquí descrito, un primer aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta de un sujeto que padece cáncer al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino, que comprende detectar y/o cuantificar en una muestra biológica de dicho sujeto la metilación del promotor del gen IGFBP-3.

En la presente invención, preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, gliomas y cáncer de mama. Más preferiblemente el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico.

El término cáncer de pulmón no microcítico, cáncer no microcítico pulmonar, carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP), carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM), o cáncer pulmonar de células no pequeñas (en inglés non-small cell lung cáncer, NSCLC) se refiere a un tipo de cáncer o tumor de pulmón que comprende, según clasificación histológica, el subtipo carcinoma escamoso o epidermoide, adenocarcinoma, adenoescamoso, carcinoma sarcomatoide, y carcinoma de células grandes.

Se entiende por tratamiento al conjunto de medios que se emplean para curar o aliviar una enfermedad.

En la presente invención se entiende como tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino a aquel tratamiento secuencial que comprende primeramente un tratamiento de quimioterapia basada en cisplatino y posteriormente un tratamiento de radioterapia según los criterios particulares de cada

caso y conocidos por el experto en la materia.

La presente invención la quimioterapia también podría estar basada en otros fármacos derivados del platino, como por ejemplo, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino y picoplatino.

Se entiende por metilación del promotor la presencia de grupos metilo en las posiciones 5 de las citosinas de la isla CpG previas y contiguas a una guanina (es decir, de un dinucleótido CG) del promotor de un gen.

Se entiende por hipermetilación al aumento de la metilación de un promotor con respecto a valores considerados normales por el experto en la materia. Se entiende por hipometilación a la disminución de la metilación de un promotor con respecto a valores considerados normales por el experto en la materia.

En la presente invención se entiendo como isla CpG aquella región del promotor de un gen que contiene al menos 500 pares de bases, una proporción de dinucleótidos CG (citosina-guanina) mayor del 50%.

En la presente invención se entiende por promotor o región promotora, a una secuencia de nucleótidos que controla la transcripción de un gen determinado, en la presente invención se trata del gen IGFBP-3.

En la presente invención se define el gen IGFBP-3 (o IGFBP3) como el gen que codifica para la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina. Dicho gen (Entrez ID: 3486) está localizado en la región cromosómica 7p12.3 y codifica para dos transcritos alternativos que comparten el mismo promotor, NM_000598.4 y NM 001013398.1. La isla CpG del gen IGFBP-3 se encuentra localizada en posición - 518/+744 respecto el primer exón y engloba 688 pares de bases por encima del sitio ATG, incluyendo el promotor descrito del gen (SEQ ID NO: 1).

La detección y/o cuantificación en la presente invención se puede realizar por cualquier método conocido por el experto en la materia, como por ejemplo, pero sin limitarnos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR específica de metilación

(MSP), MSP cuantitativa (QMSP o qMSP) o secuenciación. Previamente, el ADN puede haber sido sometido a una reacción con bisulfito previo a su detección y/o cuantificación.

El término muestra biológica incluye, pero sin limitarnos, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica comprende ácido desoxirribonucleico (ADN). Dicho ADN puede o no estar metilado y puede presentar distintos grados de metilación.

En la presente invención el término sujeto, individuo y paciente se usan indistintamente.

En la presente invención se ha demostrado que la presencia... [Seguir leyendo]

1. Método de obtención de datos útiles para predecir la respuesta de un sujeto que padece cáncer al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino, que comprende detectar y/o cuantificar en una muestra biológica de dicho sujeto la metilación del promotor del gen IGFBP-3.

2. Método in vitro para diseñar un tratamiento individualizado para un sujeto que padece cáncer que comprende detectar y/o cuantificar en una muestra biológica de dicho sujeto la metilación del promotor del gen IGFBP-3 en el que la presencia de metilación en dicho promotor es indicativa de que el tratamiento a administrar es radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde la detección y/o cuantificación de la metilación del promotor del gen IGFBP-3 se realiza en la región del promotor comprendida entre las posiciones -584 y -492 del promotor ambas inclusive.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la detección y/o la cuantificación de la metilación del promotor de gen IGFBP-3 se realiza en las posiciones -532 y -526 del promotor.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la detección y/o cuantificación de la metilación del promotor del gen IGFBP-3 se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de la polimerasa.

6. Método la reivindicación 5 donde la reacción en cadena de la polimerasa comprende el empleo de las parejas de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

7. Método según la reivindicación 6 donde la reacción en cadena de la polimerasa comprende el empleo de las parejas de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7 donde además se emplea una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

9. Método según la reivindicación 8 donde la sonda consiste en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 donde la sonda comprende en su extremo amino terminal y/o en su extremo carboxilo terminal un fluoróforo.

11. Método in vitro para la predicción de la respuesta de un sujeto que padece cáncer al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a. aislamiento de ácido desoxirribonucleico en una muestra biológica aislada de un sujeto;

b. modificación del ácido desoxirribonucleico aislado mediante bisulfito sódico;

c. hibridación con cebadores específicos;

d. amplificación de una secuencia comprendida entre los cebadores descritos en el paso (c);

e. detección de la metilación del promotor del gen IGFBP-3;

f. comparar la metilación del paso (d) con niveles estándar;

g. encontrar diferencias significativas en la comparación del paso (f);

h. asociar las diferencias significativas del paso (g) a una metilación o desmetilación del promotor del gen IGFBP-3]

i. asociar la presencia de metilación del paso (h) a una respuesta favorable al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino; o asociar la desmetilación del paso (h) a una respuesta a tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino desfavorable.

12. Método según la reivindicación 11, donde los cebadores del paso (c) son las parejas de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

13. Método según la reivindicación 12, donde los cebadores del paso (c) son SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 donde además en el paso (c) se incluye una sonda y en el paso (e) se cuantifica la metilación.

15. Método según la reivindicación 14 donde la sonda comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

16. Método según la reivindicación 15 donde la sonda consiste en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el sujeto padece cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, glioma o cáncer de mama.

18. Método según la reivindicación 17, donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en tejido, sangre, plasma, suero, linfa, lavado broncoalveolar, saliva, orina o fluido ascítico.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 donde la muestra biológica es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.

21. Sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

22. Sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7.

23. Sonda según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22 que además comprende en su extremo amino terminal y/o en su extremo carboxilo terminal un fluoróforo.

24. Uso in vitro de una sonda según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 para la detección y/o cuantificación de la metilación del promotor del gen IGFBP-3 en una muestra biológica de un sujeto.

25. Uso in vitro de una sonda según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 para determinar la respuesta de un sujeto al tratamiento de radioterapia combinado con quimioterapia basada en cisplatino.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 o 25 donde el sujeto padece cáncer.

27. Uso según la reivindicación 26 donde el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, gliomas y cáncer de mama

28. Uso según la reivindicación 27 donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico.

29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en tejido, sangre, plasma, suero, linfa, lavado broncoalveolar, saliva, orina o fluido ascítico.

30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29 donde la muestra biológica es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.

31. Kit que comprende una sonda según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23

32. Kit según la reivindicación 31 que además comprende cebadores.

33. Kit según la reivindicación 32, donde los cebadores son las parejas de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y/o SEO ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

34. Uso in vitro del kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33 para determinar y/o cuantificar de la metilación del promotor del gen IGFBP-3 en una muestra biológica de un sujeto.

35. Uso in vitro del kit según la reivindicación 34 para predecir la respuesta de un sujeto al tratamiento con radioterapia combinada con quimioterapia basada en cisplatino.

36. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 34 o 35 donde el sujeto padece cáncer.

37. Uso según la reivindicación 36 donde el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de

ovario, cáncer de cabeza y cuello, glioma o cáncer de mama

38. Uso según la reivindicación 37 donde el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón no microcítico.