Método para la inducción simultánea de CTL y células gamma delta T.

Un método in vitro para producir una población celular mixta de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células γ

δT, en que el método comprende las etapas de: añadir un antígeno de enfermedad y un aminobifosfonato a una población de células mononucleares de sangre periférica y cultivar las células mononucleares de sangre periférica resultantes que comprenden dichos CTL específicos de antígeno de enfermedad y células γ δT.

Método para la inducción simultánea de CTL y células y8T Campo de la técnica

La presente Invención se refiere a una técnica para cultivar simultánea y eficazmente CTL específicos de antígeno y células y8T eficaces en el tratamiento del cáncer. También se desvela en el presente documento el uso farmacéutico de las células cultivadas con la técnica de cultivo.

Técnica antecedente

Recientemente, la terapia inmunocelular se enfoca como una nueva terapia para enfermedades intratables incluyendo el cáncer. La terapia inmunocelular consiste en recolectar y activar los inmunocitos del propio paciente, particularmente los glóbulos blancos sanguíneos antes de reintroducirlos en el paciente para aumentar artificialmente el poder inmunizante. Esta terapia tiene la ventaja de que reduce los efectos secundarios en comparación con el tratamiento anticáncer con fármacos y similares.

Como terapia inmunocelular, ya está disponible la terapia con linfocitos autólogos activados que implica la activación de linfocitos no específicos de antígeno in vitro con una linfoquina y luego se devuelvan al cuerpo; sin embargo, existe la necesidad de que se disponga de una terapia que utilice linfocitos T citotóxicos (de aquí en adelante designados como CTL) que tengan una actividad citotóxica más fuerte y reconozcan específicamente y afecten a una lesión.

En el presente documento, como una terapia que se está intentado actualmente que utiliza los CTL, se adopta un método, por ejemplo, que implica la administración directa de un péptido antigénico del cáncer o similar a un paciente, sin embargo, en este caso, la capacidad del mismo para inducir CTL se puede mejorar debido a que el paciente a menudo tiene una inmunidad deficiente. En consecuencia, hay una terapia vacunación con células dendríticas o similares que implica poner en contacto un antígeno con células de presentación de antígenos, por ejemplo células dendríticas (de aquí en adelante designadas con DC), o similares y por lo tanto que produzcan que las células presenten con fuerza el antígeno para inducir los CTL específicos del antígeno de la enfermedad por las DC en el cuerpo.

Algunos métodos actuales típicos para inducir los CTL específicos de antígeno se muestran a continuación como ejemplos.

Por ejemplo, en los documentos no patente 1 y 2, se añaden 9-meros peptídicos tales como un epítopo para un antígeno de una enfermedad particular a las células mononucleares de sangre periférica para intentar la inducción de CTL a partir de estas. Además, en los documentos no patente 3 y 4, se obtienen DC de las células mononucleares de sangre periférica y se añade un antígeno peptídico a las mismas para que se produzca una función de presentación de antígeno; las células T positivas a CD8 separadas de los linfocitos de la sangre periférica se cultivan junto con las DC resultantes para inducir CTL específicos del antígeno de la enfermedad.

Además, en el documento no patente 5, se lleva a cabo la vacunación utilizando DC que se obtienen de células hematopoyéticas precursoras y un antígeno peptídico y luego las DC derivadas de monocitos a las que se ha añadido el antígeno se co-cultivan con las células T positivas a CD8 separadas de las células mononucleares de sangre periférica para inducir CTL específicos del antígeno.

Como se puede apreciar de sus usos en los ejemplos anteriores, las células dendríticas tienen una alta capacidad de presentar antígenos y capacidad de inducir CTL específicos del antígeno de la enfermedad entre otras células presentadoras de antígeno, por lo tanto, el desarrollo tecnológico para obtenerlas está en marcha.

Sin embargo, para obtener células dendríticas para la vacunación con células dendríticas, es necesario típicamente recolectar sangre periférica humana, separar las células llamadas monocitos de ella, y cultivarlas tras la adición de IL-4, GM-CSF y similares. Este proceso es engorroso y hasta ahora tiene el problema de que el número y función de las células cultivadas varía dependiendo de la experiencia de un técnico en cultivos celulares.

Las células y8T que se activan por un antígeno no peptídico, son células responsables de la inmunidad natural, se ha descubierto recientemente que estás células ejercen una actividad citotóxica no restringida por el MHC (actividad no específica) sobre las células cancerosas. Por lo tanto, se investiga la inmunoterapia que utiliza la fuerte actividad antitumoral de estas células y8T.

Debido a que las células y8T se activan por el reconocimiento de un antígeno no peptídico, se pueden estimular, por ejemplo, con una alquilamina o un bifosfonato como antígenos no peptídicos para su activación y/o proliferación; las células y8T separadas de la sangre periférica se han producido para reconocer antígenos no peptídicos in vitro para

llevar a cabo estudios de activación y/o proliferación de las mismas (por ejemplo, documento no patente 6).

Sin embargo, un problema de las células y8T, que están presentes en general en una cantidad de solo el 1 a 5% de la sangre periférica, es que no se puede asegurar la pureza y el número de células y8T suficiente para el tratamiento médico si se recolecta una pequeña cantidad de sangre y después se activan y/o proliferan las células recolectadas. El aumento de la cantidad de sangre recolectada de un paciente para asegurar la pureza y cantidad de células y8T suficientes para el tratamiento médico también supone un problema que impone una gran carga al paciente.

El documento patente 1 también desvela un método que implica la adición de un bifosfonato a las células mononucleares de sangre periférica para activar y proliferar las células yST.

Por lo tanto el cultivo y uso de células más eficaces son muy importantes para la terapia inmunocelular; todavía se está llevando a cabo el desarrollo de una amplia variedad de métodos y técnicas.

Además, se cultiva mayoritariamente un tipo celular bajo las condiciones presentes y se utiliza para el tratamiento médico en terapia inmunocelular, sin embargo, probablemente se podrían mezclar vahas células, dadas las características que se han descrito anteriormente y utilizarse en un tratamiento médico, por ejemplo CTL específicos de antígeno de enfermedad que se dirigen para atacar células o tejidos de manera restringida al MHC, por ejemplo, específicamente a un antígeno presente en el MHC clase I y las células yST que atacan células o tejidos de una manera no restringida al MHC.

Sin embargo, para cultivar una pluralidad de tipos de células inmunitarias para el tratamiento médico, las etapas de cultivo tienen que llevarse a cabo concurrentemente para varios de los tipos en práctica. Las condiciones de cultivo adecuadas para cada tipo de células son distintas entre sí, si se utiliza un método de cultivo convencional adecuado para un tipo de células, sería muy difícil, por ejemplo, cultivar simultánea y eficazmente cantidades suficientes de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células yST para que ejerzan un efecto terapéutico, y tales métodos de cultivo e inducción eficaces aún no se ha perfeccionado.

Listado de citas

Documentos de Patente

Documento de Patente 1: WO 26/672 Documentos No patente

Documento No patente 1: Sugiyama H. et al. Cáncer Immunol. Immunother. Dic. 22; 51 (11-12):614-2. Epub. 18 ct., 22.

Documento No patente 2: Appella E. etal. J. Immunol. 1 Mar., 1995; 154(5):2257-65.

Documento No patente 3: Fujita S. etal. Blood 1 Jun., 2; 95(1):286-93.

Documento No patente 4: Yasukawa M. et al. Clin. Cáncer Res. Ago 22; 8(8):2626-31.

Documento No patente 5: Palucka AK. et al. J. Exp.Med. 7 de Jun, 24; 199(11): 153-11. Epub Jun 1, 24. Documento No patente 6: Fumi Miyagawa et al. The Journal of Immunology 21; 166(9):558-5514.

Sumario de la invención

Problema técnico

En vista de las circunstancias descritas anteriormente, la presente invención tiene como objetivo la inducción y cultivo simultáneamente y eficazmente de una cantidad suficiente de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T para que ejerzan un efecto terapéutico en un cultivo de una etapa.

Solución del problema

Los presentes inventores han llevado a cabo varios estudios para resolver estos problemas y han creado la siguiente invención. La presente invención es de la siguiente manera:

(1) Un método in vitro para producir una población celular mixta de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T, que se caracteriza porque comprende las etapas de adición de un antígeno de enfermedad y un aminobifosfonato a una población de células... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para producir una población celular mixta de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T, en que el método comprende las etapas de: añadir un antígeno de enfermedad y un aminobifosfonato a una población de células mononucleares de sangre periférica y cultivar las células mononucleares de sangre periférica resultantes que comprenden dichos CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T.

2. El método de producción de una población celular mixta de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de adición de un antígeno de enfermedad y un aminobifosfonato se lleva a cabo el primer día del cultivo.

3. El método de producción de una población celular mixta de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el aminobifosfonato es ácido pamidrónico, ácido alendrónico, ácido zoledrónico, ácido rlsedrónico, ácido ¡bandrónlco, ácido ¡ncadrónico, una sal de los mismos y/o un hidrato de los mismos.

4. El método de producción de una población celular mixta de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antígeno de enfermedad es un antígeno del cáncer.

5. El método de producción de una población celular mixta de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el antígeno de enfermedad y el aminobifosfonato se añaden simultáneamente.

6. Un método de producción de un agente farmacéutico que comprende la producción de CTL específicos de antígeno de enfermedad y células y8T por el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.