Método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células en cultivos celulares y programas informáticos para llevar a cabo el método.

Método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células en cultivos celulares y programas informáticos para llevar a cabo el método.

El método comprende adquirir una secuencia de imágenes de fluorescencia de un cultivo celular; segmentar dicha secuencia de imágenes de fluorescencia e identificar la ubicación, forma y tamaño de cada célula que forma parte del cultivo; medir el nivel de fluorescencia de cada célula identificada para determinar una concentración de un ion de Calcio en cada célula identificada; estimular mediante un aporte externo de energía eléctrica dicho cultivo a una determinada frecuencia de estimulación; determinar la respuesta de cada célula identificada a dicha frecuencia de estimulación; y determinar una respuesta global de dicho cultivo estimulado mediante dicho aporte externo de energía eléctrica y analizar la propagación eléctrica de dicho estímulo en forma de una elevación local de la concentración del ion de Calcio a dicha frecuencia de estimulación.

DESCRIPCiÓN

Método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células en cultivos celulares y programas informáticos para llevar a cabo el método

Sector de la técnica La presente invención concierne en un primer aspecto, en general, a un método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células, tal como células cardiacas del tipo cardiomiocitos o células del sistema nervioso del tipo neuronas, en cultivos celulares, basado en imágenes de microscopia de fluorescencia, y en particular a un método que comprende identificar la respuesta dinámica de dichas células a un estímulo externo de energía eléctrica, y analizar la propagación de dicho estímulo externo de energía eléctrica en forma de una elevación local de la concentración de un ion de Calcio (Ca2+) en dichas células.

Un segundo aspecto de la invención concierne a programas informáticos adaptados para realizar algunas de las etapas del método del primer aspecto.

Estado de la técnica anterior Los cardiomiocitos son células cardiacas que tienen la particularidad de contraerse. La contracción se regula por la concentración del ion de Calcio (Ca2+) tanto en el medio intracelular como en el extracelular, y para medir esta concentración normalmente se utiliza una técnica de microscopia de fluorescencia convencional o confocaL Generalmente, en un experimento típico se dispone de un cultivo de células cardiacas y se estimula eléctricamente un extremo del cultivo para ver cómo se propaga el impulso eléctrico a lo largo del cultivo en forma de un elevación local de la concentración del ion de Calcio que se graba como una cantidad mayor de luz perteneciente a las regiones donde la concentración del ion de Calcio es más elevada.

Son conocidas diversas propuestas relativas para la clasificación de la respuesta celular a dichos estímulos eléctricos, y de esta forma se permite realizar una caracterización de su dinámica, es decir, se modifica el ritmo de estimulación para poder observar cómo reacciona el cultivo. La mayoría de dichas propuestas se hallan descritas en artículos especializados, algunos de los cuales serán citados a continuación, y descritos brevemente, por considerarse como representativos del estado de la técnica más cercano a la presente invención.

Por ejemplo, el documento 'Stochastic Approximation Techniques Applied to Parameter Estimation in a Biological Model' C. Renotte, A Vande Wouwer, da a conocer un proceso para modelar dinámicamente un conjunto de células animales a partir de un conjunto de datos experimentales. Para ello, utiliza unas variantes de unos algoritmos SP de primer y segundo orden y se aplican a la estimación estadistica con máxima verosimilitud de parámetros cinéticos y a las condiciones iniciales un modelo de procesamiento biológico de mediciones experimentales procedentes de unos cuantos componentes macroscópicos.

Por otro lado, el documento 'Automated Semantic Analysis of Changes in Image Sequences of Neurons in Culture' Omar AI-Kofahi, da a conocer un método automatizado para cuantificar el comportamiento dinámico de neuronas generando varios niveles de detalle de las mismas. Para ello, el método utiliza un criterio de selección de modelo bayesiano que aprovecha un conjunto de cambios a corto plazo de los modelos de neuronas y toma en consideración pruebas adicionales aportadas por un cambio de una máscara de iluminación-insensible.

El documento, 'Non-Invasive, Label Free, Quantitative Characterisation of Uve Cells in Monolayer Culture' Jing Zhang et al, describe el desarrollo de una nueva técnica para caracterizar poblaciones de células utilizando un microscopio óptico de onda evanescente y un software predictivo que permite el estudio cuantitativo de los procesos celulares y de células vivas de calidad en alta resolución sin el uso de etiquetas.

Se conocen también algunas patentes relacionadas con el análisis dinámico de muestras biológicas, por ejemplo, el documento EP 2435834 que divulga un nuevo mecanismo que particularmente mide los estados transitorios del ion de Calcio en un sistema celular.

Sin embargo, en ninguna de las citadas propuestas se permite, al mismo tiempo y de una manera automática, relacionar conjuntamente la escala a nivel celular y la escala a nivel de tejido debido a que las técnicas de microscopia actuales no permiten obtener imágenes de cultivos celulares con la suficiente resolución como para adquirir el detalle de cada célula por separado, de este modo no es posible caracterizar o conocer cuando una respuesta individual de una célula tiene consecuencias en la respuesta colectiva.

Explicación de la invención Por tanto, existe un interés general para poder caracterizar la propagación de ciertos iones, como el ion de Calcio (Ca2+) , en cultivos celulares bajo un estimulo externo de energia eléctrica a nivel celular De este modo se puede relacionar la respuesta dinámica de la concentración del ion de Calcio, de manera automática, tanto a nivel celular como a nivel de tejido.

El procedimiento propuesto se aplica a dicha finalidad y su gran utilidad, es por ejemplo, que se puede observar cómo se modifica la propagación del ion de Calcio en función de: la concentración de fármacos candidatos para modular la dinámica del ion de Calcio+, o en función de la presencia de células con mutaciones genéticas con un marcador fluorescente que regulan la dinámica del ion de Calcio.

La invención proporciona para ello, de acuerdo a un primer aspecto, un método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células en cultivos celulares. El método comprende a) adquirir una secuencia de imágenes de fluorescencia de un cultivo celular; b) segmentar dicha secuencia de imágenes de fluorescencia de dicho cultivo celular e identificar la ubicación, forma y tamaño de cada célula que forma parte de dicho cultivo celular; c) medir el nivel de fluorescencia de cada célula identificada para determinar una concentración del ion de Calcio en cada célula identificada; d) estimular, mediante un aporte externo de energia eléctrica, dicho cultivo celular a una determinada frecuencia de estimulación; e) determinar la respuesta de cada célula identificada a dicha determinada frecuencia de estimulación; y f) determinar separadamente una respuesta global de dicho cultivo celular, estimulado por el citado aporte externo de energía eléctrica, y analizar la propagación eléctrica de dicho estimulo eléctrico en forma de una elevación local de la concentración del ion de Calcio a dicha determinada frecuencia de estimulación.

Generalmente la metodología consíste en tres tramos de estímulacíón donde, partiendo de un estado de reposo, se estimula a un ritmo (frecuencia) cada vez con mayor velocídad hasta alcanzar una sítuacíón de inestabilidad. De este modo se puede emular por ejemplo una situación de exigencia cardiaca.

Además, en una realización preferida y característica del método propuesto, se correlaciona la respuesta de cada célula identificada a dicha determinada frecuencia de estimulación con la respuesta global de dicho cultivo celular permitiendo determinar la incidencia de dicha respuesta de cada célula con dicha respuesta global.

Las imágenes de fluorescencia preferiblemente son obtenidas mediantes técnicas de microscopía de fluorescencia convencional o confocal. En cuanto al tipo de células sobre las que es posible aplicar el método propuesto por la invención, éstas pueden ser células excitables como miocitos, en particular cardiomiocitos, o células del sistema nervioso del tipo neuronas, en función del ejemplo de realización.

La segmentación de la secuencia de Imágenes se realiza, según un ejemplo de realización, mediante un filtro, por ejemplo un filtro Watershed, adaptado al tamaño de la célula que se quiera identificar.

Preferiblemente, en la mencionada etapa c) , se normaliza el nivel de fluorescencia medido para determinar la concentración del ion de Calcio a un nivel basal de cada célula identificada.

En un ejemplo de realización preferido, la determinación de la respuesta de cada célula se determina realizando una clasificación y etiquetación de dicha respuesta en al menos uno de los siguientes regímenes dinámicos: respuesta regular, respuesta alterna, bloqueo, presencia de una onda, respuesta irregular o inactiva.

La respuesta de la célula se clasifica en base a su comportamiento en relación a los estímulos eléctricos aplicados. Preferiblemente, los estímulos eléctricos serán aportados periódicamente. La respuesta regular significa que la célula responde de forma regular a cada estimulo eléctrico. En la respuesta alterna la célula responde...

1. Método implementado por ordenador para caracterización dinámica de células en cultivos celulares, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) adquirir una secuencia de imágenes de fluorescencia de un cultivo celular;

b) segmentar dicha secuencia de imágenes de fluorescencia de dicho cultivo celular e identificar la ubicación, forma y tamaño de cada célula que forma parte de dicho cultivo celular;

c) medir el nivel de fluorescencia de cada célula identificada para determinar una concentración de un ion de Calcio en cada célula identificada;

d) estimular mediante un aporte externo de energía eléctrica dicho cultivo celular a una determinada frecuencia de estimulación;

e) determinar la respuesta de cada célula identificada a dicha frecuencia de estimulación; y f) determinar separadamente una respuesta global de dicho cultivo celular estimulado mediante dicho aporte externo de energía eléctrica y analizar la propagación eléctrica de dicho estímulo eléctrico en forma de una elevación local de la concentración del ion de Calcio a dicha determinada frecuencia de estimulación.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende determinar la incidencia de dicha respuesta de cada célula con dicha respuesta global mediante una correlación de la respuesta de cada célula identificada a dicha determinada frecuencia de estimulación con la respuesta global de dicho cultivo celular.

3. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha segmentación de la secuencia de imágenes se realiza mediante un filtro adaptado al tamaño de la célula que se quiera identificar.

4. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende normalizar dicho nivel de fluorescencia medido de cada célula identificada para determinar la concentración del ion Calcio a un nivel basal de cada célula identificada.

5. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha determinación de la respuesta de cada célula identificada a dicha determinada frecuencia de estimulación comprende clasificar la respuesta individual de cada célula en al menos uno de los siguientes regímenes dinámicos: respuesta regular,

respuesta alterna, bloqueo, presencia de una onda, respuesta irregular o inactiva.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque comprende además etiquetar el comportamiento dinámico de cada célula clasificada en base a dichos regimenes dinámicos.

7. Método según la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque comprende además variar dicha determinada frecuencia de estimulación y aplicar un test estadistico que mide el cambio en el número de células que responden según cada régimen dinámico cada vez que se varia dicha determinada frecuencia de estimulación.

8. Método según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además realizar al menos uno de los siguiente cálculos: un histograma de la medida de las células identificadas, la posición de cada célula identificada en dicho cultivo celular, la cantidad total de células pertenecientes a un mismo régimen dinámico, la respuesta de cada célula identificada dependiendo de su tamaño, mapas con la distribución espacial de la respuesta de cada célula.

9. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho análisis de la propagación eléctrica del cultivo celular comprende calcular al menos la velocidad lineal y angular de la respuesta global de dicho cultivo celular.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además clasificar la propagación de la actividad en dicho cultivo celular en al menos uno de los siguientes modos: propagación plana desde los electrodos, propagación plana en cualquier otra dirección o propagación curvada o en espiral.

11. Método según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende realizar dicha estimulación por aporte externo de energia eléctrica periódicamente.

12. Método según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichas imágenes de fluorescencia son obtenidas mediantes técnicas de microscopia confocal o mediante un microscopio óptico de fluorescencia.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha o dichas células son células cardiacas del tipo cardiomiocitos o células del sistema nervioso del tipo neuronas.

14. Programa informático de ordenador que comprende medios de código de programa informático que ejecutados en un ordenador implementan el método según las etapas e) y f) de la reivindicación 1.

15. Programa informático de ordenador que comprende medios de código de programa informático que ejecutados en un ordenador implementan dicha correlación de la respuesta de cada célula identificada a dicha determinada frecuencia de estimulación con la respuesta global de dicho cultivo celular.