Medio de cultivo para la detección de microorganismos por fluorescencia asociando un sustrato fluorogénico y un fluorófo sensible al pH.

Un medio de cultivo para detectar la presencia de microorganismos,

caracterizado por que comprende un soporte nutritivo líquido, en el que están solubilizados uniformemente:

- al menos un sustrato fluorogénico que puede ser activado por al menos una enzima de un microorganismo, en donde el al menos un sustrato fluorogénico es una mezcla de los siguientes compuestos:

-1-(2-benzoilfenil)-6-cloro-1H-indol-3-il-beta-glucopiranósido;

-1-(2-benzoilfenil)-6-cloro-1H-indol-3-il-beta-galactopiranósido;

acetato de (1-[2-(2,4-dimetoxibenzoil)fenil]-1H-indol-3-ilo; y

fosfato de (1-[2-(2,4-dimetoxibenzoil)fenil]-1H-indol-3-ilo

y

- al menos un fluoróforo, cuya fluorescencia es indicativa del pH de dicho medio de cultivo,

siendo preferiblemente la fluorescencia del propio soporte nutritivo líquido insensible a las variaciones en pH del medio de cultivo y a la introducción de dichos microorganismos en el medio de cultivo.

Medio de cultivo para la detección de microorganismos por fluorescencia asociando un sustrato fluorogénico y un fluorófo sensible al pH

La presente solicitud se refiere a un método y medios para ensayar la esterilidad de fluidos acuosos o gaseosos usados, en particular, en la fabricación de productos y dispositivos farmacéuticos.

En particular, se refiere a un medio de cultivo que combina un sustrato fluorogénico y un fluorófero sensible al pH que es de uso para la detección de microorganismos por fluorescencia, en particular acoplando las medidas de fluorescencia relacionadas con los fluoróforos sensibles al pH y las medidas de fluorescencia relacionadas con la activación del (de los) sustrato(s) fluorogénico(s) por los microorganismos.

La industria farmacéutica es uno de los sectores donde las restricciones de esterilidad son muy grandes, obligando a un seguimiento constante de la calidad de los productos y de todas las actividades que rodean a estos productos.

En términos de contaminación por microorganismos, el ensayo se lleva a cabo usando métodos microbiológicos según las normativas y estándares estipulados en la farmacopea.

La farmacopea europea o estadounidense define varios niveles de calidad microbiológica de las preparaciones farmacéuticas.

Los productos que se requiere que sean estériles, tales como preparaciones parenterales (productos inyectables, preparaciones para perfusiones, etc.) y productos oftálmicos, se caracterizan por una total ausencia de microorganismos capaces de reproducirse bien por si mismos o bien en un organismo huésped.

Los productos que no se requiere que sean estériles pueden contener un cierto número de microorganismos, a condición de que la contaminación microbiana esté contenida por debajo de un cierto umbral definido según los criterios de la farmacopea. La presencia de estos microorganismos no representa ningún peligro al paciente, dado que esto implica, por ejemplo, medicamentos administrados por vía oral o rectal. La flora microbiana y el pH ácido del estómago impiden el desarrollo de los microorganismos, a condición, sin embargo, de que el número de los mismos no exceda los criterios recomendados por dicha farmacopea. Se definen en la farmacopea diversas categorías de productos no estériles, teniendo cada uno sus propios requisitos en términos de ensayo microbiológico según su propósito final.

Los productos a ser ensayados están, además, en diversas formas sólidas o líquidas y también en diversos volúmenes y envasados. A este respecto, se puede hacer una distinción entre productos filtrables, cuyo ensayo microbiológico puede ser llevado a cabo por medio de filtración a través de una membrana, y productos no filtrables, para los que la farmacopea recomienda la técnica de inoculación directa del objeto ensayado en un medio de cultivo.

Las preparaciones que pueden ser ensayadas por inoculación directa del medio de cultivo son generalmente sólidas, pero también pueden tener una consistencia fluida, por ejemplo líquidos oleosos, a los que se añade un medio suplementado con 10 g/l de polisorbato 80, y pomadas y cremas, a las que se añaden diluyentes o emulsionantes adecuados. Es habitual que el volumen del objeto no exceda de 10% del volumen del medio de cultivo.

Dependiendo de los requisitos regulatorios, se pueden llevar a cabo diversos tipos de ensayo de la calidad microbiológica, que van desde el ensayo de esterilidad estricta hasta el recuento específico de los principales microorganismos aeróbicos y anaeróbico, e incluyendo la detección enfocada a microorganismos específicos.

En general, cuando se desea tener una idea muy precisa del tipo de microorganismos encontrados, los microbiólogos prefieren cultivos en medio de cultivo de agar, que hacen posible hacer un hallazgo visual de la presencia de los microorganismos, que forman microcolonias dentro de o sobre el agar. Esta estrategia hace posible, si se requiere, tomar muestras de los microorganismos que forman estas colonias, y realizar análisis adicionales para verificación. Así, cuando los microorganismos son de naturaleza diferente, es posible determinar, hasta cierto punto, la proporción relativa de los diversos tipos de microorganismos encontrados.

Dicho esto, los cultivos en medio de cultivo de agar requieren tiempo y mano de obra. Así, el tiempo de división de microorganismos de crecimiento lento, por ejemplo Methylobacter sp. en un medio de cultivo, tal como medio R2A, pensado para causar el crecimiento de microorganismos estresados por un tratamiento con cloro, puede ser de 48 a 72 h [(Gallego V., García M.T. y Ventosa A. (2006), Methylobacterium adhaesivum sp., nov., a methylotrophic bacterium isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol Microbio! 56, 339-342)]. Estudios muestran, además, que es necesario un periodo de incubación mínimo de 14 días para validar realmente la ausencia de microorganismos en una muestra [Bathgate, H. et al. (1993) Journal ofParenteral Science and Technology 47(5): 254-257].

En el contexto de los ensayos de inspección llevados a cabo en una cadena de producción industrial, este periodo es demasiado largo para poder tratar rápidamente una contaminación. Esto es porque, si la contaminación es establecida varios días después de la fabricación de un producto, la retirada de este producto para verificación puede causar grandes pérdidas financieras. El problema puede ser también uno de salud pública, con respecto al

ensayo de la calidad del agua potable, que es distribuida rápidamente después del tratamiento.

Los cultivos en medio líquido, por su parte, hacen posible, hasta cierto punto, reducir la mano de obra y el tiempo para cultivar los microorganismos. Sin embargo, los riesgos de falsos positivos relacionados con el manejo de membranas de filtro y/o de las placas de agar son más altos.

Las unidades de preparación estériles transparentes, por ejemplo las desarrolladas por el solicitante (Steritest EZ, Millipore Corporation, Billerica, MA 01821, USA), para llevar a cabo un ensayo de esterilidad después de la filtración de una muestra líquida o gaseosa, existen desde hace varios años. El principio es retener, en la superficie de la membrana, los posibles contaminantes contenidos en la muestra que es filtrada, y después, una vez que la filtración de la muestra ha sido llevada a cabo, incubar la membrana de filtro dentro de la unidad de filtro llenada con medio de crecimiento estéril.

En el caso de que estén presentes uno o más contaminantes, el medio, que es transparente, se vuelve turbio debido al desarrollo de las células. La presencia de microorganismos en la unidad de filtro es establecida entonces visualmente.

La detección en medio líquido requiere generalmente un poco más de tiempo que en medio de cultivo de agar, dado que se necesita alcanzar una concentración suficiente de células en el medio de cultivo para que este último se vuelva turbio. Los cultivos en medio líquido son, sin embargo, generalmente más favorables para el crecimiento de microorganismos aeróbicos o anaeróbicos.

Los ensayos en medios líquidos tienen, por otra parte, ciertas limitaciones, entre las cuales está, en particular, el hecho de que es imposible estimar el número, la naturaleza y la proporción de los contaminantes inicialmente presentes en la muestra ensayada.

A este respecto, los ensayos llevados a cabo en un medio de cultivo líquido sólo hacen posible proporcionar un mensaje de advertencia, pero sin proporcionar información en cuanto a la naturaleza de los microorganismos implicados.

Por estas diversas razones, sería deseable poder tener ensayos disponibles en medio líquido que fueran más rápidos y capaces de dar una primera indicación en cuanto a la naturaleza de los microorganismos identificados.

Como mínimo, la información sobre los tipos de microorganismos encontrados (una o más especies, aeróbicos o anaeróbicos, de crecimiento lento o de crecimiento rápido, gram + o gram -, etc.), obtenida en una fase temprana, sería ventajosa para que un técnico pudiera conocer el grado de contaminación y determinar su origen.

A fin de detectar contaminaciones más rápidamente, algunos métodos usan sustratos fluorogénicos que son incorporados en los medios de cultivo.

Los sustratos fluorogénicos son moléculas complejas que, en contacto con enzimas sintetizadas por los microorganismos, son escindidas y se vuelven fluorescentes. La fluorescencia emitida es fácilmente detectable con un espectrofotómetro iluminando el medio de cultivo usando radiación en el espectro UV o visible, antes de que la densidad de las células sea suficiente para hacer turbio al medio de cultivo. Por lo tanto permiten... [Seguir leyendo]

1. Un medio de cultivo para detectar la presencia de microorganismos, caracterizado por que comprende un soporte nutritivo líquido, en el que están solubilizados uniformemente:

- al menos un sustrato fluorogénico que puede ser activado por al menos una enzima de un microorganismo, en donde el al menos un sustrato fluorogénico es una mezcla de los siguientes compuestos:

-1-(2-benzoilfen¡l)-6-cloro-1H-indol-3-il-beta-glucopiranósido;

-1-(2-benzoilfen¡l)-6-cloro-1H-indol-3-il-beta-galactopiranósido;

acetato de (1 -[2-(2,4-dimetoxibenzoil)fenil]-1 H-indol-3-ilo; y

fosfato de (1 -[2-(2,4-dimetoxibenzoil)fenil]-1 H-indol-3-ilo

y

- al menos un fluoróforo, cuya fluorescencia es indicativa del pH de dicho medio de cultivo,

siendo preferiblemente la fluorescencia del propio soporte nutritivo líquido insensible a las variaciones en pH del medio de cultivo y a la introducción de dichos microorganismos en el medio de cultivo.

2. Un medio de cultivo según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho fluoróforo, cuya fluorescencia es Indicativa del pH de dicho medio de cultivo, se selecciona de ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico (HPTS), un compuesto de cianina o uno de sus derivados, o un compuesto de fluoresceína o uno de sus derivados, sales o ásteres.

3. Un medio de cultivo según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicho fluoróforo, cuya fluorescencia varía dependiendo del pH del medio de cultivo, es carboxifluoresceína o una de sus sales o ásteres.

4. Un método para detectar microorganismos en una muestra, caracterizado por que comprende cultivar dicha muestra, para la que se busca determinar si está contaminada por un microorganismo vivo, en un medio de cultivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un método para detectar microorganismos según la reivindicación 4, caracterizado porque la muestra ensayada es un filtro o una membrana que sirvió de antemano para filtrar un volumen de agua o gas.

6. Un método para detectar uno o varios microorganismos en una muestra, caracterizado por que comprende las

siguientes etapas:

(i) colocar dicha muestra en un medio de cultivo que comprende:

- al menos un sustrato fluorogénico que puede ser activado por al menos una enzima de un microorganismo, en donde el al menos un sustrato fluorogénico es una mezcla de los siguientes compuestos:

-1-(2-benzoilfenil)-6-cloro-1H-indol-3-il-beta-glucopiranósido;

-1-(2-benzoilfenil)-6-cloro-1H-indol-3-il-beta-galactopiranósido;

acetato de (1-[2-(2,4-dimetoxibenzoil)fenil]-1H-indol-3-ilo; y

fosfato de (1-[2-(2,4-dimetoxibenzoil)fenil]-1H-indol-3-ilo

y

- al menos un fluoróforo, cuya fluorescencia es indicativa del pH de dicho medio de cultivo, en condiciones que permiten el crecimiento de los microorganismos que se buscan;

(ii) analizar dicho medio de cultivo con respecto a la fluorescencia a fin de determinar la fluorescencia relacionada con la activación del sustrato fluorogénico contenido en el medio de cultivo por dicho microorganismo, y determinar la fluorescencia emitida por el fluoróforo cuya fluorescencia es indicativa del pH del medio de cultivo,

(iii) analizar las medidas de fluorescencia determinadas para el fluoróforo cuya fluorescencia es indicativa del pH, así como para el sustrato fluorogénico, para determinar la presencia o ausencia del tipo o tipos de microorganismo(s) buscado(s) en el medio de cultivo.

7. Un método según la reivindicación 6, caracterizado por que dicho medio de cultivo es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Un método para detectar microorganismos según la reivindicación 6 o 7, caracterizado por que en la etapa i),

dicho microorganismo es filtrado de antemano en una membrana antes de ser puesto en cultivo.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por que en la etapa ii) la fluorescencia se mide a intervalos regulares para obtener una variación en fluorescencia en función del tiempo.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque en la etapa iii) las medidas 5 de fluorescencia se comparan con medidas estándar referenciadas en una base de datos.

11. Un kit para detectar microorganismos, caracterizado por que comprende:

- un medio de cultivo para microorganismos;

- al menos un sustrato fluorogénico soluble en dicho medio de cultivo, en donde el al menos un sustrato fluorogénico es una mezcla de los siguientes compuestos:

-1-(2-benzo¡lfenil)-6-cloro-1H-¡ndol-3-il-beta-glucopiranós¡do;

-1-(2-benzoilfenil)-6-cloro-1H-¡ndol-3-il-beta-galactopiranós¡do;

acetato de (1 -[2-(2,4-dimetoxibenzoil)fenil]-1 H-indol-3-ilo; y

fosfato de (1 -[2-(2,4-dimetoxibenzoil)fenil]-1 H-indol-3-ilo,

- al menos un fluoróforo, soluble en dicho medio de cultivo, cuya fluorescencia es indicativa del pH de dicho medio

de cultivo.

12. Un kit de detección según la reivindicación 11, caracterizado por que el medio de cultivo está envasado en forma deshidratada.