Líneas de algodón transgénico Cry1F y Cry1Ac y su identificación específica de evento.

Una semilla de algodón que comprende en su genoma el evento cry1Ac del algodón 3006-210-23,

en la que el evento del algodón 3006-210-23 es una secuencia polinucleotídica del inserto cry1Ac que consiste en los nucleótidos 528-8900 de SEQ ID NO:2 y al menos 20 nucleótidos flanqueantes contiguos en ambos lados de dicha segunda secuencia del inserto, en la que los nucleótidos flanqueantes-5' proceden de los restos nucleótidos 1-527 de SEQ ID NO:2, y los nucleótidos flanqueantes-3' proceden de los restos nucleótidos 8901-9382 de SEQ ID NO:2.

Líneas de algodón transgénico Cry1F y CrylAc y su identificación específica de evento Antecedentes de la invención

El algodón es un importante cultivo para la obtención de fibras. Se ha aplicado el cruzamiento y la biotecnología al algodón para mejorar sus rasgtos agronómicos y la calidad del producto. Uno de estos rasgos agronómicos es la resistencia a insectos, cuyas ventajas son claramente evidentes. Se han introducido genes que codifican proteínas insecticidas en plantas de algodón. Para mitigar la inquietud de que un tipo conceto de insecto pueda desarrollar resistencia a un único tipo de proteína insecticida, a menudo se desarrollan plantas que producen dos tipos diferentes de proteínas insecticidas. Así, la probabilidad de que un insecto sea capaz hipotéticamente de desarrollar resistencia a dos proteínas insecticidas diferentes es extremadamente baja.

En la técnica se conocen los genes y las proteínas insecticidas Cry 1 Ac. Véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU n.°s 6.114.138; 5.710.020; 6.251.656; y 6.229.004. En la técnica también se conocen los genes y las proteínas insecticidas Cry1F. Veánse, por ejemplo, las patentes de EEUU n.os5.188.960; 5.691.308; 6.096.708; y 6.573.240.

La expresión de genes extraños en plantas se ve influida por el lugar en que se inserta el gen extraño en el cromosoma. Esto puede ser debido a la estructura de la cromatina (por ejemplo, heterocromatina) o a la proximidad de elementos de regulación transcripcional (por ejemplo, potenciadores) cercanos al sitio de integración (Weising et al., Ann. Rev. Genet., 22:421-477, 1988). Por ejemplo, el mismo gen en el mismo tipo de planta transgénica (u otro organismo) puede mostrar una amplia variación en el nivel de expresión entre diferentes eventos. También pueden existir diferencias en los patrones de expresión espacial o temporal. Por ejemplo, las diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos vegetales pueden no corresponderse con los patrones esperados a partir de los elementos reguladores transcripcionales presentes en la contrucción del gen introducido.

Así, es necesario crear y seleccionar un gran número de eventos para identificar un evento que exprese óptimamente un gen de interés introducido. Para fines comerciales, es habitual producir de cientos a miles de eventos diferentes y seleccionar los eventos para un único evento que tenga los patrones y niveles de expresión del transgén deseados. Un evento que tenga los patrones y niveles de expresión del transgén deseados es útil para introgresar el transgén en otros entornos genéticos mediante cruzamiento exogámico sexual empleando métodos de cruzamiento convencionales. La progenie de estos cruzamientos mantiene las características de expresión del transgén del transfórmente original. Esta estrategia se emplea para asegurar la expresión fiable de genes en una serie de variedades que están bien adaptadas a las condiciones de crecimiento locales.

Sería ventajoso poder detectar la presencia de un evento concreto para determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un método para detectar un evento concreto sería útil para cumplir con las normas que requieren de una aprobación antes de la comercialización y el etiquetado de alimentos derivados de plantas de cultivos recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier método de detección de ácidos nucleicos conocido, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación de ADN empleando sondas de ácidos nucleicos. Estos métodos de detección general se centran en elementos genéticos empleados con frecuencia, tales como promotores, terminadores, genes marcadores y similares. Como resultado, estos métodos pueden no ser útiles para discriminar entre diferentes eventos, en particular los producidos empleando la misma construcción de ADN, a menos que se conozca la secuencia del ADN cromósomico adyacente al ADN insertado (ADN flanqueante). Un ensayo de PCR específico de evento se analiza, por ejemplo, en Windels et al. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent., 64/5b:459462, 1999). Esto se relaciona con la identificación del evento de soja tolerante al glifosato 40-3-2 mediante PCR empleando un conjunto de cebadores que abarca la unión entre el inserto y el ADN flanqueante, más concretamente, un cebador incluye una secuencia del inserto y un segundo cebador incluye una secuencia del ADN flanqueante.

Las solicitudes de patente de EEUU 20020120964 A1 y 20040009504 A1 se refieren al evento del algodón PV- GFIGT07(1445) y a composiciones y métodos para su detección. El documento WO 02/100163 se refiere al evento del algodón MONI5985 y a composiciones y métodos para su detección. El documento WO 2004/011601 se refiere a plantas con el evento del maíz MON863 y a composiciones y métodos para su detección. El documento WO 2004/072235 se refiere al evento del algodón MON 88913 y a composiciones y métodos para su detección. El documento WO 02/40677M se refiere al evento del algodón 531.

Sin embargo, hasta la fecha no se conocen específicamente procedimientos y materiales que puedan utilizarse para identificar específicamente el algodón apilado Cry 1F y/o C/y1Ac, según se analiza a continuación.

Breve sumario de la invención

Esta invención se refiere al cruzamiento de plantas y a la protección de plantas frente a insectos. Más concretamente, esta invención incluyen nuevos eventos de transformación de plantas de algodón que comprenden una o más secuencias polinucleotídicas, según se describen en la presente, insertadas en un sitio o sitios específicos dentro del genoma de una célula de algodón. En realizaciones muy preferidas, dichas secuencias polinucleotídicas codifican las proteínas inhibidoras del insectos lepidópteros Cry1F y CrylAc apiladas. Sin

embargo, la presente invención incluye plantas que presentan un único evento CrylAc, según se describe en la presente.

También se describen ensayos para detectar la presencia de uno o más de los presentes eventos en una muestra. La presente invención describe ADN y ensayos relacionados para detectar la presencia de ciertos eventos de resistencia a insectos en el algodón. Los ensayos se basan en las secuencias de ADN de construcciones recombinantes insertadas en el genoma del algodón y de las secuencias genómicas que flanquean los sitios de inserción. También se proporcionan kits y condiciones útiles para realizar los ensayos.

Así, la presente invención se refiere, en parte, a la clonación y el análisis de secuencias de ADN de insertos c/y 1 Ac completos y sus regiones limítrofes (en líneas de algodón transgénico). Estas secuencias son exclusivas. Basándose en estas secuencias de insertos y limítrofes, se generaron cebadores específicos de evento. Un análisis de PCR demuestra que estos eventos pueden indentificarse mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores específicos de evento. Así, pueden emplearse estos y otros procedimientos relacionados para identificar con exclusividad líneas de algodón que comprenden uno o más eventos de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra el transgén c/y 1F insertado y las secuencias flanqueantes para el evento del algodón 281-24-236. Esta figura también muestra los amplicones y los cebadores descritos en la presente.

La figura 2 ilustra el transgén c/y1Ac insertado y las secuencias flanqueantes para el evento del algodón 3006-210- 23. Esta figura también muestra los amplicones y los cebadores descritos en la presente.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO:1 es la secuencia de ADN para el inserto del evento c/y1F de 281-24-236 y sus secuencias limítrofes.

SEQ ID NO:2 es la secuencia de ADN para el inserto del evento c/ylAc de 3006-210-23 y sus secuencias limítrofes.

SEQ ID NO:3 es la secuencia del cebador directo 281-14 empleado con el cebador inverso 281-15 para amplificar

un amplicón de 603 pb que abarca la unión 5 entre las regiones flanqueantes y del Inserto del evento c/y1F de 281- 24-236.

SEQ ID NO:4 es la secuencia del cebador Inverso 281-15 empleado con el cebador directo 281-14 para amplificar un amplicón de 603 pb que abarca la unión 5 entre las reglones flanqueantes y del inserto del evento c/y1F de 281- 24-236.

SEQ ID NO:5 es la secuencia de 603 pb del amplicón producido empleando los cebadores de SEQ ID NO:3 y 4.

SEQ ID NO:6 es la secuencia del cebador directo 281-9 empleado con el cebador inverso 281-10 para amplificar

un amplicón de 562 pb que abarca la unión 3 entre las reglones flanqueantes y del Inserto... [Seguir leyendo]

1.- Una semilla de algodón que comprende en su genoma el evento crylAc del algodón 3006-210-23, en la que el evento del algodón 3006-210-23 es una secuencia polinucleotídica del inserto crylAc que consiste en los nucleótidos 528-8900 de SEQ ID NO:2 y al menos 20 nucleótidos flanqueantes contiguos en ambos lados de dicha 5 segunda secuencia del inserto, en la que los nucleótidos flanqueantes-5 proceden de los restos nucleótidos 1-527 de SEQ ID NO:2, y los nucleótidos flanqueantes-3 proceden de los restos nucleótidos 8901-9382 de SEQ ID NO:2.

2 - La semilla de algodón de la reivindicación 1, en la que la semilla comprende SEQ ID NO:2 en su genoma.

3 - Una planta de algodón producida cultivando la semilla de la planta de la reivindicación 1 o 2.

4.- Una planta de algodón de una progenie resistente a insectos de la planta de la reivindicación 3, en la que dicha 10 planta de algodón de la progenie comprende al menos un evento crylAc del algodón 3006-210-23 según la

reivindicación 1.

5.- La planta de la reivindación 3, en la que dicha planta de algodón comprende los restos 508-8920 de SEQ ID NO:2.

6.- Una parte de la planta de algodón de la reivindicación 4, en la que dicha parte se selecciona del grupo que 15 consiste en flores, cápsulas, hilas, brotes, raíces y hojas, y dicha parte comprende dicho polinucleótido.

7.- Un polinucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO:2.

8.- Una planta de algodón que comprende una secuencia genómlca que comprende el polinucleótido según la reivindicación 7 en su genoma.

9.- Una semilla producida por una planta de algodón de la reivindicación 8, en la que dicha semilla comprende SEQ 20 ID NO:2 en su genoma.