Procedimiento para la realización y evaluación de ensayos de mezclado y medición para la medición de cinéticas de reacción así como de concentraciones y afinidades de analitos en formato múltiplex.

Procedimiento para el análisis múltiplex de varios analitos que comprende las etapas de:

a) Utilizar un portador, sobre el que están inmovilizadas al menos dos poblaciones de micropartículas diferentes, diferenciándose las diferentes poblaciones de micropartículas en su codificación de fluorescencia y conteniendo al menos dos de las poblaciones de micropartículas con codificación de fluorescencia diferentes en cada caso micropartículas, que están ocupadas con una determinada población de moléculas aceptoras específica, diferenciándose entre sí las poblaciones de moléculas aceptoras de las al menos dos poblaciones de micropartículas con codificación de fluorescencia diferentes.

b) Medir la fluorescencia del portador de la etapa a) con una resolución óptica 1 antes de poner en contacto el portador con la muestra que va a analizarse o antes del inicio de la reacción, permitiendo la resolución 1:

- una diferenciación de singletes, dupletes, tripletes, multipletes y monocapas de micropartículas, y

- la determinación de la situación local de las micropartículas inmovilizadas individuales de las respectivas al menos dos poblaciones de micropartículas diferentes sobre el portador teniendo en cuenta la codificación de fluorescencia en cada caso diferente de las al menos dos poblaciones de micropartículas diferentes.

c) Poner en contacto el portador de la etapa a) con la muestra que va a analizarse, provocando la interacción del respectivo analito con la molécula aceptora específica para el mismo sobre la micropartícula inmovilizada correspondiente una variación de la fluorescencia.

d) Realizar al menos una medición adicional de la fluorescencia del portador durante o después de la puesta en contacto o del inicio de la reacción según la etapa c) con una resolución 2.

e) Asociar los valores de fluorescencia medidos con la resolución 2 con los singletes, dupletes, tripletes, multipletes y monocapas de micropartículas individuales identificados localmente sobre el portador según la etapa b) y asociados a una determinada población de moléculas aceptoras.

f) Determinar la variación de la fluorescencia mediante la puesta en contacto según la etapa c) para cada singlete de micropartículas identificado localmente y cada micropartícula en un duplete, triplete, multiplete y monocapa sobre el portador.

Procedimiento para la realización y evaluación de ensayos de mezclado y medición para la medición de cinéticas de reacción así como de concentraciones y afinidades de analitos en formato múltiplex

La invención se refiere en general al campo de la amplificación de ácidos nucleicos, de la enzimología y de la inmunología. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para la medición en tiempo real (real time) de cinéticas de reacción en el formato de prueba de mezclado y medición (Mix & Measure), registrándose y evaluándose varios parámetros al mismo tiempo (múltiplex). También son objeto de la invención un sistema de medición de fluorescencia multicolor con regulación térmica, una matriz de perlas así como un kit para detectar moléculas diana en la matriz, preferiblemente para PCR en fase líquida, PCR en fase sólida y PCR múltiplex.

Los procedimientos para determinar analitos en una muestra se realizan en tiempo real como ensayos de mezclado y medición, para ahorrar costes y tiempo durante la realización de la determinación o para mejorar la exactitud así como la robustez de las pruebas. Las pruebas de este tipo se utilizan por ejemplo para la selección farmacéutica de alto rendimiento o el análisis de ácidos nucleicos en el diagnóstico médico.

A este respecto, en la mayoría de los casos es muy importante regular la temperatura de reacción, es decir mantener la temperatura constante, crear un gradiente o atemperar ciclos térmicos rápidos de manera idéntica o con diferentes evoluciones mientras se registran y procesan de manera continua los parámetros de medición. A menudo se detectan señales de fluorescencia, dado que éstas pueden combinarse de manera variada con el formato de ensayo de mezclado y medición. Las variaciones, por ejemplo, de las intensidades de la fluorescencia, de la duración de la fluorescencia o de la polarización de la fluorescencia pueden ser indicadores de, por ejemplo, concentraciones de analitos que varían en muestras o de interacciones intermoleculares y pueden medirse sin contacto, es decir en diferentes formatos de prueba, en un recipiente de reacción cerrado. Por formatos de prueba de mezclado y medición se entiende un procedimiento de análisis, en el que todos los componentes que reaccionan permanecen en un compartimento de medición hasta el registro de señales.

De procedimientos para el reconocimiento y la determinación de cantidades de ácidos nucleicos, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se conoce que, a modo de ejemplo, necesitan todas las condiciones previas mencionadas anteriormente para poder realizarse de manera óptima. La PCR puede utilizarse para afirmaciones tanto cualitativas como cuantitativas. Una determinación de cantidades de productos de PCR puede tener lugar de diferentes maneras. Los métodos de detección recientes permiten medir la síntesis in vitro de productos de PCR "en tiempo real", es decir de manera homogénea directamente en el recipiente de reacción de PCR usado en cada caso, en la fase líquida. Esta denominada PCR en tiempo real es un método especialmente sensible. En este sentido, en cada ciclo de la PCR se hace un seguimiento de la generación de productos de PCR. La medición de la amplificación tiene lugar a este respecto por regla general en termocicladores, que presentan medios adicionales para la medición de señales de fluorescencia durante la reacción de amplificación. Los productos de amplificación se detectan por ejemplo mediante muestras de hibridación marcadas con fluorescencia, que sólo fluorescen en caso de unión al ácido nucleico diana, o mediante colorantes fluorescentes que se unen a ADN bicatenario. Se establece un valor umbral de señal definido para todas las reacciones analizadas y se determina el número de ciclos (Cp) necesario para alcanzar el valor umbral tanto para el ácido nucleico diana como para los ácidos nucleicos de referencia. Basándose en los valores Cp obtenidos para el ácido nucleico diana así como el ácido nucleico de referencia pueden determinarse entonces los números de copias o bien absolutos o bien relativos de la molécula diana.

Un procedimiento reciente para detectar una molécula de ácido nucleico específica usa denominadas "balizas moleculares" (Tyagi et al. documento US 6.15.97A). Las balizas moleculares son oligonucleótidos marcados con colorante, que tienen una estructura de tallo-bucle. En los dos extremos libres de los fragmentos de tallo (el extremo 3 y el 5) está acoplado en cada caso un fluoróforo, actuando uno como colorante indicador y el otro como colorante extintor, que extingue la fluorescencia del colorante indicador en caso de una proximidad espacial suficiente mediante transferencia de energía por resonancia Fórster (FRET). Las secuencias de los fragmentos de tallo en ambos extremos de las balizas moleculares se seleccionan de tal manera que, cuando se dobla la baliza molecular, los fragmentos de tallo se hibridan exclusivamente entre sí, pero no con otros fragmentos del oligonucleótido. La separación entre el colorante indicador y el colorante extintor es suficientemente pequeña en el estado de los fragmentos de tallo hibridados, de modo que el colorante fluorescente tampoco fluoresce en caso de una excitación adecuada con luz. El fragmento de bucle presenta una secuencia, que es complementaria a la secuencia de una secuencia diana. Si las balizas moleculares y las moléculas de ácido nucleico que presentan secuencia diana se encuentran en una disolución, los fragmentos de bucle y los fragmentos de secuencia diana pueden hibridarse, con lo que se desdobla la baliza molecular con la disolución de la hibridación de ambos fragmentos de tallo. Este desdoblamiento conduce al aumento de la separación espacial entre el colorante indicador y el colorante extintor, y el colorante indicador se excita para dar fluorescencia. En caso de observar de manera continua la intensidad de fluorescencia puede establecerse un aumento de la intensidad cuando las balizas moleculares detectan las secuencias diana y se hibridan con las mismas. Así pueden detectarse cuantitativamente las moléculas de ácido nucleico. Estas balizas moleculares tienen la gran desventaja de una síntesis compleja y cara, dado que estas sondas deben marcarse tanto con el colorante fluorescente como con el colorante extintor. Los sistemas de colorante extintor-colorante fluorescente se aprovechan en sistemas de sondas comparables tales como sondas de

cebador Amplifluor, Scorpions y TaqMan.

Un sistema conocido adicional es el sistema Light-Cycler. En este caso se distribuyen los colorantes fluorescentes en dos oligonucleótidos diferentes. En el extremo 3 del primer oligonucleótido se encuentra un colorante fluorescente (por ejemplo fluoresceína), un colorante fluorescente adicional se encuentra en el extremo 5 del oligonucleótido que se añade en el sentido de 3 (por ejemplo LC Red 64). La fluoresceína se excita por un LED como fuente luminosa y emite luz, que a través de FRET excita la segunda molécula fluorescente. La luz emitida por el segundo colorante se mide a través de un filtro de fluorescencia con detector. Una excitación del segundo colorante sólo puede tener lugar cuando mediante la adición de ambos oligonucleótidos en su hebra complementaria las dos moléculas de colorante se encuentran en proximidad espacial (distancia de 1 a 5 nucleótidos). El principio de este sistema se basa en la excitación secundaria de un segundo colorante fluorescente, que no se posibilita hasta la generación del producto de PCR.

Dichos sistemas pueden utilizarse básicamente para aplicaciones múltiplex, pero tienen la desventaja en la detección paralela de diferentes secuencias objetivo, que la mezcla básica de reacción se vuelve relativamente cara debido al número creciente de diferentes sondas de detección y que el número creciente de sondas puede perjudicar la reacción de amplificación. Además no se conocen suficientes pares de FRET para conseguir un alto grado de múltiplex.

En la implementación técnica de ensayos de ácido nucleico para estudios rutinarios son importantes: el ensayo homogéneo, el procedimiento múltiplex así como las micromatrices (también denominadas chips génicos o biochips). En una PCR múltiplex con el sistema de cebador/sonda o el kit pueden combinarse varios conjuntos de cebadores con el procedimiento descrito anteriormente, que debido a diferentes secuencias permiten la detección de varias secuencias objetivo, sin embargo en la mayoría de los casos no más de cinco, en una mezcla básica de reacción. Las mediciones cualitativas tienen lugar comprobando tras un número definido previamente de ciclos de amplificación, si la concentración de las moléculas de ácido nucleico acopladas supera un... [Seguir leyendo]

Procedimiento para el análisis múltiplex de varios analitos que comprende las etapas de:

a) Utilizar un portador, sobre el que están inmovilizadas al menos dos poblaciones de mlcroparticulas diferentes, diferenciándose las diferentes poblaciones de microparticulas en su codificación de fluorescencia y conteniendo al menos dos de las poblaciones de mlcroparticulas con codificación de fluorescencia diferentes en cada caso microparticulas, que están ocupadas con una determinada población de moléculas aceptaras específica, diferenciándose entre si las poblaciones de moléculas aceptaras de las al menos dos poblaciones de mlcroparticulas con codificación de fluorescencia diferentes.

b) Medir la fluorescencia del portador de la etapa a) con una resolución óptica 1 antes de poner en contacto el portador con la muestra que va a analizarse o antes del ¡nielo de la reacción, permitiendo la resolución 1:

una diferenciación de singletes, dupletes, tripletas, multipletes y monocapas de microparticulas, y

la determinación de la situación local de las microparticulas inmovilizadas individuales de las respectivas al menos dos poblaciones de microparticulas diferentes sobre el portador teniendo en cuenta la codificación de fluorescencia en cada caso diferente de las al menos dos poblaciones de microparticulas diferentes.

c) Poner en contacto el portador de la etapa a) con la muestra que va a analizarse, provocando la interacción del respectivo analito con la molécula aceptara específica para el mismo sobre la micropartícula inmovilizada correspondiente una variación de la fluorescencia.

d) Realizar al menos una medición adicional de la fluorescencia del portador durante o después de la puesta en contacto o del inicio de la reacción según la etapa c) con una resolución 2.

e) Asociar los valores de fluorescencia medidos con la resolución 2 con los singletes, dupletes, tripletas, multipletes y monocapas de microparticulas individuales identificados localmente sobre el portador según la etapa b) y asociados a una determinada población de moléculas aceptaras.

f) Determinar la variación de la fluorescencia mediante la puesta en contacto según la etapa c) para cada singlete de microparticulas identificado localmente y cada micropartícula en un duplete, tripleta, multiplete y monocapa sobre el portador.

Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el portador estructurado o no estructurado según la reivindicación 1, etapa a) presenta zonas planas que pueden observarse al microscopio.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque las microparticulas están codificadas por fluorescencia mediante uno o varios colorantes fluorescentes en la partícula o en la superficie de la partícula y adicionalmente están codificadas por tamaño a través del tamaño de partícula o codificadas por estructura mediante patrones morfológicos y por consiguiente pueden asociarse a poblaciones de microparticulas diferenciadas.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las microparticulas están compuestas por un núcleo y al menos una envuelta, pudiendo diferenciarse los materiales de núcleo y envuelta en composición, forma, densidad, transparencia, capacidad de modificación y presentando diferentes codificaciones de fluorescencia con al menos un colorante fluorescente, pudiendo utilizarse colorantes fluorescentes diferentes o idénticos.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en el portador según la reivindicación 1, etapa a) están inmovilizadas adicionalmente células vivas o destruidas o células en combinación con microparticulas.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el analito se marca directamente o indirectamente a través de una molécula adicional con una fluorescencia de ligando o un extintor.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la reducción de la fluorescencia mediante extinción de la fluorescencia superficial o la pérdida de la fluorescencia superficial de la superficie de la partícula se produce durante la degradación de las moléculas aceptaras durante la reacción.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el aumento de la fluorescencia de ligando mediante la neutralización de la extinción de sistemas de indicador, mediante FRET o mediante

enriquecimiento local de moléculas de fluorescencia de ligando sobre la superficie de la partícula se produce mediante la interacción con las moléculas aceptoras o el analito asi como mediante el desplazamiento de moléculas extintoras durante la reacción.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque a la mezcla de reacción para el aumento del 5 contraste de la fluorescencia de ligando se le añaden un colorante extintor o nanopartfculas que absorben

luz.

11.

12.

13.

14.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se utiliza un aparato de medición para la medición de variaciones de fluorescencia, que comprende:

un control completamente automático por medio de ordenador,

un termociclador para la atemperación rápida de las muestras, con una velocidad de calentamiento/enfriamiento de 3-2°C por segundo, que presenta una zona de reacción con varios alojamientos que pueden atemperarse para portadores según la reivindicación 1, etapa a),

un dispositivo de posicionamiento para el termociclador y/o el entorno de reacción que puede controlarse de manera termocíclica,

uno o varios dispositivos de iluminación asociados a la zona de reacción con los que puede irradiarse luz de excitación,

un dispositivo óptico que es adecuado preferiblemente para la detección de fluorescencia con luz transmitida o luz reflejada con filtros ópticos correspondientes,

uno o varios dispositivos de detección (por ejemplo CCD, CMOS), que generan imágenes en función de una intensidad de fluorescencia medida, y

una unidad de evaluación, que genera valores de medición a partir de las imágenes.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 1, caracterizado porque durante el registro de puntos de medición adicionales sólo se registra o se procesa adicionalmente la fluorescencia superficial o de ligando de un número de pfxeles definidos mediante coordenadas espaciales de las partículas seleccionadas previamente según el punto de medición 1.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las diferentes fluorescencias de partícula se comparan entre sí y/o con la fluorescencia superficial o con el tamaño de partícula, para decodificar las al menos dos poblaciones de micropartículas diferentes.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque los valores de medición registrados en la evolución de tiempo o en diferentes ciclos de reacción de los puntos de medición adicionales de una serie de medición de un mismo lugar de medición toman como referencia uno o varios valores de medición de la misma señe de medición, del mismo lugar de medición o también de otros lugares de medición.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque las diferentes fluorescencias de partícula de diferentes capas de partículas se comparan entre sí y/o con la fluorescencia superficial/de ligando o con el tamaño de partícula, para decodificar las poblaciones de micropartículas y/o establecer una referencia para la fluorescencia superficial o la fluorescencia de ligando.